茯神中乳酸脱氢酶抑制剂的提取筛选与质谱分析

庄思远，周旭，刘箬瑶，刘春明，李赛男，张语迟

长春师范大学中心实验室（长春 130032）

茯神（Poria cumRadix Pini）是多孔菌科（Polyporaceace）真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]的干燥菌核中间抱有松根的部分。茯神中主要含有多糖类和三萜类化学成分[1-3]，其三萜类化合物是主要的药效成分之一[4]。现代研究表明，三萜具有抗炎[5]、抗肿瘤[6]、抗病毒[7]、抗氧化[8]等作用。

常用的三萜提取方法有浸提法、回流法、超声微波协同提取法。传统的浸提法，提取时间长、能耗高、提取率低。超声提取是一种新型的物理提取技术，能显著提高活性成分得率[9-10]。此次试验采用响应面法优化超声波辅助溶剂提取法提取茯神中总三萜成分，对其提取工艺参数进行优化。

乳酸脱氢酶是生物体内糖酵解途径中一种至关重要的氧化还原酶。肿瘤对人类健康有着极大的危害。乳酸脱氢酶在调节肿瘤细胞之间的能量代谢的过程中具有重要作用，使其成为抗肿瘤治疗的新靶点[11]。以超滤技术作为快速活性筛选方法，以茯神三萜类化合物为研究目标，筛选茯神中乳酸脱氢酶抑制剂。

超滤质谱是“超滤”技术和“质谱”技术的一种完美结合[12-13]。首先选取生物酶如乳酸脱氢酶等作为与疾病相关的生物靶分子，将酶和小分子在体外进行孵化和结合，对结合产物进行分离并进行质谱分析，筛选能够与酶结合的分子。超滤质谱技术适用于从传统中药中筛选乳酸脱氢酶抑制剂，该方法快速、灵敏，具有高通量的特点，为肿瘤等治疗药物的筛选与开发提供了科学有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

茯神，长春市同仁堂药店，经长春师范大学中心实验室刘春明教授鉴定为茯神。

1.1.2 供试试剂

乳酸脱氢酶（生产批号：1001918117），瑞士Fluka公司；齐墩果酸（批号：H04J9Z62784）、对照品3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸、去氢茯苓酸（Y03D7S25360）、茯苓酸（Y05J8S39371）和松苓新酸（Y08J7H8750），上海源叶生物科技有限公司；其他试剂（均为分析纯），北京化工厂；PBS缓冲溶液，瑞士Bueke公司；UPLC流动相所用乙腈（色谱纯），美国Thermo Fisher公司；试验用水为超纯水，美国Millipore公司。

1.1.3 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；分析型色谱柱（Sun FireTMC18色谱柱250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），美国Waters公司；恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；UPLC-Q Extractive MS超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱仪，美国Thermo Scientific公司；离心机，美国Sigma公司；超滤离心管，德国Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 茯神总三萜的提取工艺

将茯神置于搅拌机中绞碎，称取1.0 g粉末于烧杯中，按一定比例加入适量体积分数的乙醇，在一定温度和时间下进行超声提取。提取结束后，将提取液进行过滤。将滤液定容到25 mL容量瓶中，备用。

1.2.2 茯神提取总三萜的单因素试验

设计提取试验中各单因素考察情况，如表1所示。除说明考察变量条件不同外，其他影响因素均设置为料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数90%、提取时间1 h、提取次数1次。

表1 茯神提取总三萜单因素试验设计表

1.2.3 茯神总三萜提取率优化

在单因素试验基础上，对总三萜提取的影响因素进行优化。利用Design-Expert 8.0软件设计中心组合试验，进行分析，研究茯神总三萜的最佳提取工艺。试验中茯神总三萜提取率的各影响因素与其对应的水平编码设计如表2所示。

表2 响应面法分析因子及水平表

1.2.4 总三萜含量的测定

1.2.4.1 标准曲线绘制

准确称取5.0 mg干燥的齐墩果酸标准品置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇超声溶解，稀释至刻度摇匀，即为质量浓度0.2 mg/mL的标准品溶液。分别精确吸取0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6和0.7 mL该标准品溶液于5 mL容量瓶中，水浴挥尽溶剂，加0.3 mL新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，于75 ℃反应15 min，冰水冷却，加冰醋酸至刻度，摇匀，在550 nm波长下测定吸光度[10]。以齐墩果酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得吸光度与浓度的回归方程y=72.314x-0.066 4，R2=0.999。结果表明齐墩果酸在0.002～0.014 mg/mL范围内与吸光度A呈现良好的线性关系，如图1所示。

图1 齐墩果酸标准曲线

图1 齐墩果酸标准曲线

1.2.4.2 茯神总三萜的提取及含量测定

准确称取1.0 g茯神粉末，加入一定体积的乙醇溶液，在规定温度下超声提取一定时间后，减压过滤，定容至25 mL容量瓶中，吸取2 mL，按照1.2.4.1测定样品吸光度，按式（1）计算总三萜得率[14]。

采用单因素试验考察超声时间、超声次数、料液比、乙醇体积分数对茯神总三萜提取率的影响，依据单因素试验结果确定因素水平范围，利用Design-Expert 8.0为辅助手段设计响应面试验。

1.2.5 高效液相色谱条件

色谱柱：Sun FireTMC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），以乙腈（A）和水（B）作为液相色谱流动相，洗脱方式为梯度洗脱。流动相梯度程序：0～20 min，50%～80% A，20～35 min，80%～92% A，35～42 min，92% A，42～52 min，92%～95% A，52～57 min，95% A，57～90 min，95%～100% A；流速：0.3 mL/min；波长：210 nm，进样量：20 μL，柱温：30 ℃。

1.2.6 UPLC-Q-Exactive条件

高效液相色谱选择二元线性梯度洗脱：流动相A为0.2%醋酸水溶液，流动相B为乙腈。流动相梯度程序：样品进样量10 μL；检测波长210 nm；柱温30 ℃。液相色谱二极管阵列检测器（DAD）通过三通阀与质谱连接，质谱离子源为电喷雾离子源（ESI），分析模式为负离子模式；扫描范围m/z100～1000；离子肼条件：离子源喷雾电压为4.5 kV，鞘气辅助气为氮气，流速为20 L/min，离子肼压力为3.1×107Pa；金属毛细管温度为350 ℃，金属毛细管电压为3.5V。

1.2.7 乳酸脱氢酶抑制剂活性测定

20 μL 50 mg/mL样品溶液分别与90 μL 0.2 U/mL乳酸脱氢酶、0.5 U/mL乳酸脱氢酶、1.0 U/mL乳酸脱氢酶，在100 μL PBS缓冲溶液37 ℃水浴锅中孵育30 min，将未结合的小分子与结合的复合物通过超滤膜分离。在室温下，用超滤膜过滤（YM-30000 Da）并离心（12000×g）10 min。加入100 μL 50%甲醇水溶液（50∶50，V/V，pH 3.30）冲洗结合的化合物，通过离心机离心10 min，若膜上还残留有结合的复合物，则重复上一步骤。空白组试验用相同体积的PBS缓冲溶液替代酶，其他条件与试验组相同，最后得到的溶液用高效液相色谱检测。

增强因子反映了三萜类物质与乳酸脱氢酶的结合能力的大小[15]。样品对酶的增强因子按式（2）计算。

式中：A1为与乳酸脱氢酶结合的化合物的吸光度；A2为未与乳酸脱氢酶结合的化合物初始的吸光度。

2 结果分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总三萜提取率的影响

称取1.0 g茯神粉末，分别加入20 mL 60%，70%，80%，90%和95%乙醇，超声提取1 h，提取1次，离心，按标准曲线项下测定样品吸光度，计算总三萜提取率，结果如图2所示。

图2 乙醇体积分数对总三萜提取率的影响

如图2所示，随乙醇体积分数的增加，提取率呈现出先增大而后逐渐下降的趋势，在70%时提取率达到最高。主要原因可能是增大乙醇体积分数可以促使细胞溶胀，有利于提取剂向细胞内部的渗透，从而提高总三萜的提取率。但乙醇体积分数过高，导致溶液体系的极性下降，使茯神中的醇溶性与脂溶性杂质竞争溶剂，水溶性三萜不易溶出，导致总三萜提取率呈现出下降的趋势。因此选择乙醇体积分数70%为最佳提取体积分数。

2.1.2 料液比对总三萜提取率的影响

称取1.0 g茯神粉末，分别加入10，15，20，25和30 mL 70%乙醇，超声提取1 h，离心，按标准曲线项下测定样品吸光度，计算总三萜提取率，料液比与总三萜提取率的关系如图3所示。

由图3可知，随溶剂用量的增加，总三萜的提取率相应增高，由于溶剂用量增加，药材与溶剂接触面积增大，并且能够增大固液浓度差，有利于扩散速度的提高。当溶剂用量大于15 mL时，总三萜的提取率增高趋势变缓，为避免溶剂浪费，料液比选择1∶15（g/mL）。

图3 料液比对总三萜提取率的影响

2.1.3 提取时间对总三萜提取率的影响

称取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，分别超声提取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，离心，按标准曲线项下测定样品吸光度，计算总三萜提取率，超声时间与总三萜提取率的关系如图4所示。

由图4可知，超声波在较短时间内能够对茯神总三萜进行充分的提取，超声时间越长，总三萜提取率越高。但超过1 h，总三萜提取率增大缓慢，可能由于超声时间过长，其他物质也会溶出，在提取溶剂量不变的情况下会影响三萜物质的溶出。故超声时间选取1 h。

图4 提取时间对三萜提取率的影响

2.1.4 提取次数对三萜提取率的影响

称取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，超声提取1.0 h，分别提取1，2，3和4次，离心，按标准曲线项下测定样品吸光度，计算总三萜提取率，超声时间与总三萜提取率的关系如图5所示。

由图5可知，随提取时间的增加，总三萜的提取率相应增高，可能是提取次数增加，可以使药材与溶剂接触面积增大，提取率不断增大。当提取次数为3次时，总三萜的提取率增高趋势变缓。为了节省时间，提取次数选取3次。

图5 提取次数对总三萜提取率的影响

2.2 响应面优化茯神总三萜提取工艺

2.2.1 响应面回归模型的建立与分析

响应面优化茯神总三萜提取试验结果如表3所示。

表3 响应面试验设计方案与试验结果

运用Design-Expert 8.0软件对数据进行回归拟合，求得茯神总三萜提取率（Y）与乙醇体积分数（A）、料液比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）的方程：Y=0.54+8.556E-003A+0.028B+0.041D+0.012C+0.012AB-0.02AC+0.026AD+0.019BC+7.937E-003BD-3.313E-003CD-0.023A2-0.064B2-0.055C2+1.586E-004D2。因素的方差分析见表4。

表4 方差分析

由表4可以得出，模型F=40.90，p＜0.000 1，建立的模型极显著（p＜0.01）。该数学模型与茯神总三萜的实际提取率情况拟合良好。对各因素进行综合分析表明：一次项A、D不显著，B、C极显著，说明乙醇体积分数和提取时间2个因素的影响较小，提取次数对提取率影响显著且最大，其次为料液比；交互项基本不显著，说明4个因素之间的交互变化影响相对较小。在超声提取过程中，各因素对总三萜提取得率影响的三维响应面如图6所示。

图6 茯神总三萜超声提取响应面图

由图6可知，随乙醇体积分数的增加，三萜提取率先升高后降低，这可能的原因是：其他醇溶性杂质溶出，导致三萜类组分的溶出量相对减少，但乙醇体积分数对三萜提取率影响不大；增加提取时间，能够提高三萜提取率，但是增加的比例比较缓慢，说明增加提取时间对三萜提取率的影响不大；增加料液比和提取次数，能提高三萜提取率，可能是由于增加料液比与次数有利于三萜物质的溶出。

2.2.2 最佳提取工艺的预测和试验验证

根据Design-Expert 8.0建立的数学模型确定优化后的茯神总三萜提取工艺条件：乙醇提取体积分数70%、提取时间1 h、提取次数3次、料液比1∶15（g/mL）。在此条件下，模型推测提取率为1.98%。对优化后的茯神总三萜提取工艺条件进行验证试验，结果显示，茯神总三萜提取率为2.106%±0.002%，符合预期结果。

2.3 茯神三萜提取物对乳酸脱氢酶的抑制作用

20 μL茯神提取物溶液（50 mg/mL）未与乳酸脱氢酶结合的对照组以及分别与20 μL不同活度乳酸脱氢酶（0.2，0.5和1.0 U/mL）结合的试验组的液相色谱图如图7所示。

图7 茯神石油醚层提取物与乳酸脱氢酶结合的HPLC图

图7表明，茯神提取物中有4个成分可以与0.2，0.5和1.0 U/mL乳酸脱氢酶结合。分别对比各液相色谱峰面积，考察化合物与乳酸脱氢酶的结合能力。结果表明：化合物1，2，3和4对0.5 U/mL乳酸脱氢酶活性有较强的抑制作用，特别是化合物3抑制酶活性效果显著。化合物1，2，3和4与不同浓度的乳酸脱氢酶的增强因子如表5所示。

表5 茯神提取物与乳酸脱氢酶结合强度表 单位：%

综上，茯神提取物中化合物1，2，3和4与乳酸脱氢酶具有生物亲和能力，对乳酸脱氢酶有一定的抑制作用，具有潜在的抗肿瘤的活性。各化合物对乳酸脱氢酶抑制效果强弱顺序为茯苓酸（化合物3）＞松苓新酸（化合物4）＞去氢茯苓酸（化合物2）＞3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸（化合物1）。

2.4 应用HPLC-ESI-MS分析茯神石油醚层提取物中化学成分

按1.2.6小节操作，茯神石油醚层提取物中的化合物得到较好的分离，液相色谱图如图8所示。采用液相色谱与质谱联用技术和标准品比对方法，对液相色谱主要化合物色谱峰相对应的质谱数据进行分析，结果如表6所示。

图8 茯神石油醚层提取物

表6 茯神石油醚层有效成分的UPLC-Q-Exactive分析

化合物1的保留时间为37.50 min，在一级质谱中母离子为513.36[M-H]-，其二级质谱离子主要碎片是m/z467.35，m/z453.33，m/z451.32和m/z391.30，其中m/z467.35是母离子失去一个HCOOH产生的，m/z453.33是母离子失去一个CH3COOH产生的，m/z451.32是母离子失去一个HCOOH和一个CH4产生的，m/z391.30是母离子失去一个CH4、一个HCOOH和一个CH3COOH产生的[16]。结果与文献报道3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸的主要碎片一致，其保留时间与3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸标准品一致，故推测为3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸。

化合物2的保留时间为39.13 min，在一级质谱中母离子为525.34[M-H]-，其二级质谱离子主要碎片是m/z509.32，m/z465.34，m/z447.32和m/z355.22，其中m/z509.32是母离子失去一个CH4产生的，m/z465.34是母离子失去一个CH3COOH产生的，m/z447.32是母离子失去一个H2O和一个CH3COOH产生的，m/z355.22是母离子失去一个C9H14O2和一个CH4产生的[17]。结果与文献报道去氢茯苓酸的主要碎片一致，其保留时间与去氢茯苓酸标准品一致，故推测为去氢茯苓酸。

化合物3的保留时间为39.75 min，在一级质谱中母离子为527.37[M-H]-，其二级质谱离子碎片主要是m/z465.34，m/z467.35和m/z405.31，其中m/z465.34是母离子失去一个CH4和一个HCOOH产生的，m/z467.35是母离子失去一个CH3COOH产生的，m/z405.31是母离子失去一个HCOOH、一个CH3COOH和一个CH4产生的[18]。结果与文献报道茯苓酸主要碎片一致，其保留时间与茯苓酸标准品一致，故推测为茯苓酸。

化合物4的保留时间为49.12 min，在一级质谱中母离子为453.34[M-H]-，其二级质谱离子碎片主要是m/z435.27和m/z337.33，其中m/z435.27是母离子失去一个H2O产生的，m/z337.33是母离子失去两分子CH4以及C24双键麦氏重排后的产物[19-20]。结果与文献报道松苓新酸主要碎片一致，其保留时间与松苓新酸标准品一致，故推测为松苓新酸。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面分析法进行试验设计，将茯神总三萜的提取工艺进行优化，建立可较为准确预测茯神总三萜提取率的数学模型。各变量因素的影响强度：提取次数（C）最大，其次为料液比（B），乙醇体积分数（A）和提取时间（D）影响较小。茯神总三萜提取的最佳条件为乙醇提取体积分数70%、提取时间1 h、提取次数3次、料液比1∶15（g/mL），总三萜提取率可达到2.106%±0.002%。

以液-质联用技术作为研究方法，根据负离子模式下的质谱数据对茯神石油醚层提取物的化学成分进行了研究。结果表明，茯神石油醚层提取物中的化学成分主要为三萜类化合物。根据各色谱峰在质谱中的分子量和色谱保留时间，成功鉴定了茯神石油醚层提取物中4种三萜类化合物，分别为3-O-乙酰基-16α-羟基松苓新酸、去氢茯苓酸、茯苓酸和松苓新酸。

利用超滤质谱法研究茯神石油醚层提取物对乳酸脱氢酶的抑制作用，结果表明对0.5 U/mL乳酸脱氢酶活性有较强的抑制作用，验证了超滤质谱法是研究配体与酶的相互作用快速、灵敏、有效的分析方法。4种三萜类化合物与乳酸脱氢酶均具有生物亲和能力，可以抑制乳酸脱氢酶生物活性，具有潜在的抗肿瘤活性。