常规玉米与湿贮玉米不同比例组合对奶牛瘤胃体外发酵参数的影响

彭述宇，曲永利，高伟星，曲嘉晨，刘红志，苗人方

（黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

近年来，随着奶牛养殖产业的不断发展，饲料原料的短缺与开发利用也成为我国各养殖场的一大挑战。玉米能够为奶牛中提供一定量的淀粉和蛋白，是我国奶牛日粮中的重要能量饲料之一。但由于我国玉米产量供不应求，玉米价格持续增长，导致奶牛饲养成本也随之增高，探索利用玉米的新方式成为研究关注点。高水分玉米籽粒湿贮不仅可使玉米的营养成分得到长期保存、提高玉米利用率，还可降低玉米市场价格波动的影响。韩吉雨等研究发现，饲喂高水分湿贮玉米可降低奶牛饲养成本、提高生产效益。然而，饲喂大量高降解率的湿贮玉米也容易产生较多脂肪酸使瘤胃pH 降低，打破瘤胃内菌体平衡，造成乳酸积累，易引起瘤胃酸中毒的风险。目前，常规玉米与湿贮玉米在奶牛日粮中如何搭配使用尚未见报道。本试验利用体外产气法探究常规玉米与湿贮玉米间不同比例组合对奶牛瘤胃发酵的影响，筛选出适宜的比例组合，为规模化奶牛场科学利用湿贮玉米、降低奶牛饲料成本提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 籽粒水分为25%～35%、处于完熟期的全穗玉米颗粒（先达101）于2020 年10 月取自黑龙江省九三管局大西江农场玉米种植地。2020 年10 月于黑龙江省嫩江县大西江麒源牧场将其进行脱粒、粉碎、压实、密封贮藏，于2021 年6 月25 日进行采集；常规玉米采集于大庆市禾丰牧业粉碎过筛后的玉米粉。2 种饲料样品的实测常规养分见表1。

表1 湿贮玉米和常规玉米主要营养成分（干物质基础） %

1.2 瘤胃液采集 瘤胃液取自黑龙江省东北农业大学阿城试验基地3 头饲喂压缩玉米秸秆且装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛。在试验当天晨饲前2 h 采集瘤胃液，将其混合置于预先通有CO并且用瘤胃液润洗的保温瓶中，盖严后迅速带回实验室。混匀后经4 层纱布过滤，置于39℃水浴中恒温并向容器中持续通入CO，使瘤胃液保持在厌氧状况下保存待用。

1.3 体外发酵试验 采用单因素试验设计，以常规玉米作为对照组（100:0），在干物质基础上将常规玉米与湿贮玉米以不同比例组合作为发酵底物（70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、0:100），每个组合设置3 个重复，同时设置3 个空白对照组（不放置底物），用于校正产气。参考MenKe 等的方法配置缓冲液，调节pH 至6.0～7.0，预热到39℃并持续通入CO，将采集处理好的瘤胃液与缓冲液以1:2 的比例混合配置成人工瘤胃培养液，在水浴中保持39℃恒温并持续通入CO至饱和。

准确称取0.4 g 发酵底物置于饲料分析纤维滤袋中，密封后送至100 mL 的培养管底部（空白组不放入任何底物），在玻璃针管活塞表面均匀涂抹适量的医用凡士林，起到润滑和防止玻璃针管漏气作用，迅速将45 mL混合好的人工培养液分装到各培养管中，排尽管内空气并记录初始刻度，将培养管放入39℃水浴恒温振荡器（DSHZ-600）开始进行培养，经48 h 发酵后将培养管放入冷水中终止发酵。将每组平行样发酵液倒入50 mL离心管中，测定其pH 之后进行离心（4℃，4 000 r/min，30 min)，取上清液分装到10 mL 离心管中，置于-20℃冰箱中进行冷藏，用于氨态氮（NH-N）和挥发性脂肪酸（VFA）的测定。取出纤维滤袋反复清洗后，于烘箱中65℃烘干48h，测定其干物质（DM）、粗蛋白质（CP）和淀粉（Starch）含量。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 产气量（Gas Production，GP）的测定 分别在2、4、8、12、24、48 h 准确记录玻璃针管的刻度值，根据公式计算各时间点的产气量。

GPt=（Vt–V0）–（Vt–V0）

式中，GPt 为样品在t 时刻玻璃针管的刻度值（mL）；Vt为样品发酵t 小时后记录玻璃针管的刻度值；V0为样品在刚开始发酵时记录玻璃针管的刻度值；Vt为空白组发酵t 小时后记录玻璃针管的刻度值；V0为空白组在刚开始发酵时记录玻璃针管的刻度值。

1.4.2 各项参数的测定及营养物质降解率的计算 发酵液pH 采用梅特勒F2-Standard 便携式pH 酸度计测定每组发酵液的pH，重复3 次，取平均值。利用高效液相色谱法（HPLC），取经偏磷酸固氮处理冷冻保存的瘤胃液解冻后于12 000 r/min 离心10 min，取上清液用0.45 µm 水相滤膜过滤后，取20 µL 上清液分装于1.5 mL 的色谱进样瓶中上机进行HPLC 分析，通过峰面积外标法定量计算出有机酸的浓度。参照冯宗慈等比色法测定瘤胃液NH-N 的浓度。取10 mL 瘤胃液在3 500～4 000 r/min 离心10 min，量取2 mL 上清液，置于15 mL 试管内，再加入8 mL 0.2 mol/L 盐酸至10 mL摇匀，用分光光度计测定其消光值并代入回归公式，计算结果乘以样品的稀释倍数就即为原样中NH-N 浓度。将发酵结束的底物连同纤维袋用清水清洗后，于电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）65℃烘干48 h 后，使用电子天平称重为DM 含量；采用凯氏定氮法[FOSS 凯氏定氮仪（邦亿精密量仪有限公司）]测定底物残渣的CP 含量；采用淀粉试剂盒（索莱宝生物科技有限公司）测定底物残渣的Starch 含量。干物质降解率（DMD）、粗蛋白质降解率（CPD）、淀粉降解率（SD）计算公式：

DM（CP、SD）降解率=[发酵底物中DM（CP、SD）量（g）–底物残渣DM（CP、SD）量（g）]/发酵底物DM（CP、SD）量（g）×100%

1.4.3 组合效应值 参考王旭等的组合效应计算公式，计算每个组合底物发酵48 h 后测定各参数的单项组合效应值（SFAEI）和综合组合效应值（MFAEI）：

单项组合效应值=（组合实测值– 加权估算值）/加权估算值

综合组合效应值=各单项组合效应值之和

其中，加权估算值=A 原料的实测值×A 原料的百分比+B 原料的实测值×B 原料的百分比。

1.5 统计分析 采用Excel 2016 整理试验数据，通过SPSS 23.0 统计软件进行One-Way ANOVA 方差分析，Duncan's 法进行多重比较，<0.05 为差异显著，>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 常规玉米与湿贮玉米不同比例组合对48 h 体外发酵GP 的影响 由表2 得出，除12 h 之外，各发酵时间点常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合对GP 的影响差异显著（<0.05），各比例组合GP 值均随发酵时间的增加而增加，但随着发酵时长增加至12 h 后，湿贮玉米组合比例高于50:50 的组合GP 逐渐呈下降趋势。50:50组合48 h 产气量高于70:30、60:40、30:70 和0:100 组合（<0.05）。与对照组（100:0）相比，湿贮玉米组合比例低于60:40 或高于40:60 组合，随着发酵时间延长至12 h 后，GP 均低于对照组。

表2 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对GP 的影响

2.2 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对VFA 的影响 由表3 可见，与对照组相比，各比例组合丁酸浓度无显著差异；各组间丙酸、总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度存在差异显著（<0.05），且均低于对照组；70:30 比例组的乙酸浓度低于其他各组（<0.05）；乙酸/丙酸随湿贮玉米组合比例的增加随之增加（<0.05）。

表3 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对VFA 的影响

2.3 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对pH、NH-N 及营养物质降解率的影响 由表4 可见，经48 h 体外发酵之后，与对照组相比，各比例组合pH维 持在5.66～5.85（>0.05）；60:40、50:50、40:60、30:70、0:100 组合NH-N 浓度稳定在0.16～0.17 mg/dL，高于对照组和70:30 组（<0.05）。DMD 和CPD 随着湿贮玉米组合比例的增加而增加。对照组DMD 低于50:50、40:60、30:70 和0:100 组合（<0.05）；对照组的CPD 低于0:100 组合（<0.05），与其他比例组合相比均差异不显著；对照组SD 低于其他各组（<0.05），且0:100 组合最高（45.24%）。

表4 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对pH、NH3-N 及营养物质降解率的影响

2.4 常规玉米与湿贮玉米不同配合比例的组合效应值 通过SFAEI 来评定不同组合经48 h 体外发酵的组合效应。由表5 可见，GP 在70:30 组合表现出负效应；TVFA 在50:50 和30:70 组合表现出正效应；pH在70:30、60:40 和40:60 组合表现出正效应；NH-N 在70:30 组合表现出负效应；DMD 在70:30 和60:40 组合表现出负效应；CPD 在70:30 和30:70 组合表现出正效应；SD 在70:30、60:40 和50:50 组合表现出正效应。各比例组合MFAEI 在60:40、50:50、40:60 和30:70 组合表现出正效应，其中50:50 组合表现出最高值（0.597 6）。

表5 常规玉米与湿贮玉米不同配合比例的组合效应值

3 讨论

3.1 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对GP 的影响 发酵GP 反映了瘤胃液中的瘤胃微生物对饲料中碳水化合物及蛋白质含碳部分的降解活性和饲料可降解率高低，产生的气体越多，表明瘤胃微生物活性越高，可降解物质含量越高。有研究表明，产气量与干物质降解率呈正相关。本试验结果表明，各比例组合GP 值均随着发酵时间的延长随之增加，可能是不同类型饲料组合后，蛋白质与碳水化合物比例发生变化，影响饲料的发酵潜力；随着湿贮玉米比例增高、发酵时间延长，GP 值的增长幅度呈下降趋势，经48 h 发酵后，0:100 组合GP 最低（118.60 mL/g），50:50 组合GP 最高（163.00 mL/g）。祁宏伟等研究表明，玉米经过湿贮后其干物质、有机化合物及能量在奶牛瘤胃、小肠和总肠中的降解率高于干贮玉米，过高的营养物质降解率会影响瘤胃酸碱值，大量脂肪酸积累导致瘤胃酸度增加，进一步抑制有益菌的生物活性，降低了微生物对饲料中可降解物的降解能力。湿贮玉米比例越高，pH 随着发酵时间的增加而下降，瘤胃微生物活动可能受到限制，导致GP 随之降低。在50:50 组合中，可能是适当的降解率能平衡瘤胃微生物的生存环境，提供足够的可利用物使其较为充分发挥生物活性，GP 表现出最大值。

3.2 常规玉米与湿贮玉米的不同比例组合48 h 体外发酵对pH、NH-N、VFA 及营养物质降解率的影响 瘤胃pH 是能够直接反映瘤胃内环境发酵水平的一项重要指标，可综合反映瘤胃微生物和代谢产物有机酸的产生、吸收、排放及瘤胃健康状况。瘤胃液pH 范围在5.5～7.5，理想范围在6.6～7.0，瘤胃pH 过低，会引起瘤胃代谢疾病等风险。在本试验中，由于玉米经体外发酵产生的脂肪酸无法被吸收代谢，积累在瘤胃液中致使pH 降低，维持在5.66～5.85，但属于正常参考范围。

NH-N 是由饲料中含氮物质分解产生的，适宜的NH-N 浓度有利于微生物生长和菌体蛋白合成，瘤胃液中NH-N 浓度可反映饲料蛋白质降解速度和菌体蛋白的合成情况，是瘤胃代谢中的重要指标。在本试验结果中，各组合NH-N 浓度在0.09～0.17 mg/dL。但Sharif 等研究指出，瘤胃液NH-N 浓度在6.3～27.5 mg/dL 较为适宜。本试验中瘤胃液中的NH-N 浓度主要来源于降解常规玉米与湿贮玉米中的蛋白质，且相比湿贮玉米，常规玉米CPD 较低，可能与可供瘤胃微生物利用降解的蛋白质含量不足有关，生物活性有所下降，且常规玉米营养物质降解率低，产生NH-N 浓度略低，不利于微生物菌体蛋白的合成。但对照组和各组合间NH-N 浓度差异显著，常规玉米与湿贮玉米组合的NH-N 浓度显著提高；然而湿贮玉米的比例越大，pH 下降越快可能会抑制菌体活性，NH-N 浓度反而降低，说明湿贮玉米比例过高不益于微生物的生长。

VFA 主要是由乙酸、丙酸和丁酸组成，是反刍动物能量利用中一个重要中间产物，也是瘤胃微生物维持和生长的主要能量来源，瘤胃中VFA 浓度可反映瘤胃微生物对饲料中碳水化合物消化代谢活动情况，其浓度和瘤胃发酵类型等取决于饲料的种类及组成。本试验结果表明，在湿贮玉米各比例组合中，50:50 组合乙酸、丁酸和TVFA 浓度均表现出最高值，其他组合可能由于瘤胃微生物活性受限制或原料营养物质可降解率低，产生有机酸浓度略低。本研究中，与对照组相比，各组合之间随着湿贮玉米组合比例增加，乙酸/丙酸也随之增加，乙酸/丙酸为1.62～2.02。不同生理阶段泌乳奶牛瘤胃发酵产生有机酸中乙酸/丙酸的正常参考范围（1.36～5.25），本研究结果与其相符。经过一定时间的贮存发酵后，湿贮玉米含高瘤胃降解率的淀粉易产生VFA，大量积累会降低瘤胃液中pH，有益菌在pH 较低的环境中活性可能会受到抑制。而本试验供体瘤胃液为乙酸发酵型，乙酸分解菌的活性较强，在此情况下仍然能够降解玉米中的部分纤维成分提供一定量的乙酸，经发酵后致使乙酸浓度略高于丙酸。蒋林树等研究也显示，高油玉米在体外瘤胃发酵得到的乙酸浓度高于丙酸。在本试验结果也表明，与对照组相比，各组合乙酸浓度均无显著变化，而丙酸浓度随着湿贮玉米比例的增加呈下降趋势。

湿贮玉米经过一段时间的贮存发酵后，营养成分的消化率都有所提高，但饲喂大量高降解率物质也会给反刍动物瘤胃健康造成一定危害。本试验结果中，随着湿贮玉米比例增大，饲料DMD 和CPD 均随之增高，SD各组合间无显著差异，但均高于对照组，高瘤胃降解物质可能会对奶牛瘤胃环境产生影响。因此，在饲喂管理中应合理调整好常规玉米与湿贮玉米的配比，在提高玉米利用率的同时也要防止奶牛瘤胃酸中毒等情况发生。

3.3 常规玉米与湿贮玉米的组合效应值分析 通过多项试验指标对比分析，结合MFAEI 可对结果进行更为客观准确的评定。本试验结果表明，各比例组合的SFAEI 均有所不同，结合48 h 的GP 值、TVFA、pH、NH-N、DMD、CPD 和SD 计算得出的MFAEI 在70:30 组合为负值，60:40、50:50、40:60、30:70 组合均为正值，其中50:50 组合MFAEI 表现最佳。说明适宜比例组合的常规玉米与湿贮玉米能够提高奶牛瘤胃的整体发酵性能，改善饲料利用率，有助于提高奶牛生产潜能，但湿贮玉米比例过高也会给奶牛瘤胃的发酵潜力带来一定负面影响，增加湿贮玉米的饲喂风险。

4 结论

本试验结果表明，将常规玉米与湿贮玉米以不同比例组合进行奶牛体外发酵试验，通过对各项发酵参数测定结果及组合效应的计算值进行对比分析，2 种原料组合比例为50:50 时效果较好。