基于石墨烯固相萃取-毛细管电泳联用的奶嘴中痕量双酚A检测

杨钰婷，王 永，周柚廷，陈杨洁，梁 立，李惠茗，刘坤平

(1. 成都大学药学院 药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，四川 成都 610106;2. 成都大学食品与生物工程学院，四川 成都 610106)

0 引 言

双酚 A（bisphenol A，BPA），学名 2，2-二 (4-羟基苯基)丙烷，白色晶体，熔点156～158 ℃，是世界上使用最广泛的工业化合物之一。它的下游产品包括了PC、环氧树脂、聚砜树脂等多聚物材料，广泛用于日常所能接触到的塑料制品之中，如食品的外包装、PVC 管、食品盘、医用工具等[1]。BPA易水解，可从食品罐、饮料瓶和婴儿奶瓶、奶嘴等制品中释放，并通过食物进入人体并且富集。BPA作为一种典型的环境内分泌干扰物，长期接触BPA的人群易患肥胖症、糖尿病以及内分泌失调等疾病。幼儿期是体格发育的关键期，对BPA暴露的潜在风险更为易感，可能影响儿童体格发育，欧盟认为含双酚A奶瓶、奶嘴会诱发性早熟[2-4]。因此，建立快速、灵敏的奶嘴中双酚A的检测方法具有重要意义。目前，对低浓度双酚A的测定方法主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、电化学法及荧光法等[5-8]。但这些方法存在着仪器昂贵、操作繁琐、检测灵敏度低等缺点，无法满足日益增长的BPA检测的需求。

婴儿奶嘴中双酚A含量较低，无法直接进行检测，需进行前处理富集。固相萃取（SPE）是近年来发展起来的一种理想的样品前处理技术，可提高样品富集倍数并减小干扰。目前常用于SPE的吸附剂有C-18、氧化铝、大孔树脂及纳米材料等。随着纳米技术的高速发展，多种新型的纳米材料已被用做SPE小柱的吸附剂，如碳纳米管、纳米石墨等[9-11]。石墨烯是2004年发现的新型二维纳米材料，具有高比表面积（高达2 630 m2/g），高导电性（室温下载流子迁移率高达15 000 cm2/(V·s)）等优异性质，已应用于各种研究领域[12-14]。其较高的比表面积和大π共轭体系的强吸附作用，使其成为SPE吸附剂的有力候选材料。此外，毛细管电泳（CE）是一种迅速发展的新型液相分离检测技术，它以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。相比于HPLC，CE具有柱效高、分离速度快、溶剂和样品消耗量少、选择性强、仪器操作成本低、拥有多种分离模式等优点，在医学、材料学、环保和食品等领域得广泛的应用[15]。

本文首先制备高比表面积的石墨烯纳米材料，然后将其用做固相萃取吸附剂制备石墨烯基SPE小柱。利用所制备的石墨烯基SPE小柱对BPA的高效富集作用并结合CE技术的高效检测能力构建了SPE-CE联用分析方法用于婴儿奶嘴样品中BPA的高灵敏快速检测（见图1）。为食品接触材料中痕量组分的分析检测提供了可行的思路。

图1 实验原理图

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

双酚 A（BPA），丙酮，水合肼（99%），氢氧化钠，乙醇，乙醚，硼砂，十二烷基硫酸钠（SDS）均为分析纯，购自成都长征试剂公司。甲醇，乙腈购自百灵威试剂公司。固相萃取小柱空柱管，上下筛板（CNW）和商品化固相萃取小柱（SupercleanTMLC-18 SPE Tubes（500 mg））购自 Sigma-Aldrich 公司。毛细管电泳测试在P/ACE MDQ（Beckman）上进行。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在Specturm 2（PE）上测试。紫外-可见光谱（UV-Vis）在 UV-2 600 (尤尼柯)上进行。场发射扫描电子显微镜（SEM）在JSM-6 701（Kevex）上进行。透射电子显微镜（TEM）在G2-F20-STWIN（PEI）上测试。实验用超纯水均取自MilliQ纯水系统。

BPA储备液制备：精密称取0.1 g BPA，将其置于100 mL容量瓶中，加入适量甲醇，振摇使BPA溶解，最后用甲醇定容，即得1.0 mg/mL BPA储备液，4 ℃保存备用。

CE运行缓冲液配制：用电子天平称取硼砂0.436 9 g，十二烷基硫酸钠（SDS）0.432 6 g，将两者加入100 mL容量瓶中，加入适量纯化水，超声使其完全溶解。再加入4.0 mL乙腈，最后用纯水定容，即得15.0 mmol/L硼砂-十二烷基硫酸钠-乙腈缓冲液（pH 9.0），4 ℃ 保存备用。

1.2 石墨烯的制备

三颈瓶中加入50 mL蒸馏水及45 mL氧化石墨烯（EGO）分散液（0.5 mg/mL），超声使之均匀分散。再加入0.5 mL水合肼，搅拌下逐步升温至95 ℃左右反应24 h。降至室温后将反应液于15 000 r/min转速下离心，弃去上清液。下层固体经3遍蒸馏水离心洗涤至中性，烘干备用。

1.3 石墨烯基SPE小柱的制备

准确称取30.0 mg所制备的石墨烯于研钵中研成粉末，然后转移至50 mL烧杯中，加入30 mL无水乙醇于超声波中超声10 min使石墨烯粉末均匀分散。然后将该分散液逐步引流加入已放置下筛板的3.0 mL干净的空固相萃取小柱柱管内。待乙醇流出后加上上筛板，完成SPE小柱的制备。

1.4 SPE萃取过程

固相萃取之前，将制备的石墨烯基SPE小柱依次用10.0 mL甲醇和10 mL蒸馏水对其进行活化以去除可能存在的杂质。然后在真空泵的抽力下，使50.0 mL含BPA的样品溶液以2.0 mL/min的流速流过SPE小柱。用10.0 mL甲醇对吸附富集在SPE小柱内的BPA进行洗脱并收集洗脱液。将洗脱液置于75 ℃水浴中蒸干溶剂，最后以CE运行缓冲液定容至1.0 mL以供毛细管电泳测定之用。作为对比，商品化的SupercleanTMLC-18 SPE 小柱（500 mg）采用同样的方式对BPA进行富集并进行CE检测。

1.5 CE测定条件

CE测试采用经活化后的长度为50 cm（有效长度41 cm），内径50 μm的熔融石英毛细管，运行缓冲液为硼砂-十二烷基硫酸钠-乙腈缓冲液（pH 9.0），CE运行温度为25 ℃，运行电压为25 kV，PDA检测器检测波长278 nm，进样方式为0.5 psi（1 psi=6.895 kPa）压力下的气压进样，进样时间5 s。整个CE测试过程按如表1所示的运行流程进行。

表1 CE测试运行流程

2 结果与讨论

2.1 石墨烯表征

首先对所制备的石墨烯进行表征以确定石墨烯的成功制备。如图2（a）的UV-Vis光谱图所示，氧化石墨烯在230 nm和300 nm处显示出两个吸收带，分别对应于氧化石墨烯的骨架吸收和C=O双键的R吸收带。经水合肼还原后，石墨烯仅显示出一个270 nm 的吸收带，其对应于石墨烯的π-π共轭体系，表明石墨烯的大π共轭体系的恢复。300 nm处氧化石墨烯R吸收带的消失表明石墨烯表面含氧官能团的去除。此外，如图2（b）的FT-IR光谱图所示，氧化石墨烯在1 620 cm–1处表现出C=C双键的骨架振动吸收。由于氧化石墨烯表面含有丰富的C=O，C-O，C-O-C，-OH等含氧官能团，其还表现出3 400 cm–1（-OH），1 730 cm–1（C=O），1 220 cm–1（CO-C）和 1 050 cm–1（C-O）等含氧官能团的吸收峰。经水合肼还原后，石墨烯上 1 730 cm–1，1 220 cm–1和1 050 cm–1等处的吸收峰的消失或减弱表明石墨烯表面的大部分含氧官能团已被清除，表明氧化石墨烯已被成功还原为石墨烯。由图2（c）的SEM图可以看出，所制备的石墨烯表现为轻纱状半透明的层状结构。由图2（d）的TEM图可以看出，石墨烯为形状不规则的片状结构，其尺寸范围为1～12 μm。

图2 氧化石墨烯与石墨烯的表征结果

2.2 SPE萃取条件优化

在SPE固相萃取中，萃取条件的优化决定着萃取效率及最终的检测灵敏度。研究对洗脱剂种类、pH、洗脱液体积以及NaCl浓度条件进行了优化，结果如图3所示。由图可以看出，甲醇的洗脱能力最强，BPA的回收率达103%，因此，选择甲醇为最佳的洗脱溶剂。此外，分别选择pH 9.0，10 mL的甲醇洗脱液体积和60 mmol/L的NaCl盐浓度为最优的洗脱参数。

图3 SPE萃取条件优化（洗脱剂种类、pH、洗脱液体积、NaCl浓度）

2.3 CE条件的优化

为确定CE检测中PDA检测器的检测波长，对BPA进行UV-Vis全扫描，得到如图4插图所示的UV-Vis图。可以看出，BPA在278 nm处表现出最大吸收峰，因此选择278 nm为PDA检测器的检测波长。在此波长下对BPA检测得到如图4所示的CE图，可以看出BPA的保留时间为10.20 min，表现出良好的对称峰形。

图4 BPA的CE图（插图：BPA的UV-Vis）

为使CE测试达到最优的柱效和分离度，分别对CE测试电压和CE运行缓冲液进行了优化。由图5（a）可以看出，随着CE测试电压的逐渐增大（20，25，30 kV），BPA 的保留时间逐渐减小，均可在20 min内完成测试。但20 kV和30 kV时（曲线c和a），BPA峰的对称性较差，20 kV时甚至出现了严重的拖尾现象。而对于25 kV时，BPA展现出良好的对称峰形，且基线更加平稳。因此，选择25 kV为最优的CE测试电压。由图5（b）可以看出，单独使用硼砂缓冲液（曲线a）时，BPA的保留时间为4.92 min，出峰时间太早不利于BPA与杂质组分的完全分离。单独使用SDS缓冲液（曲线c）时，BPA的保留时间为13.12 min，虽然能保证BPA主峰和杂质组分的完全分离，但出现了前拖现象，而且基线也出现了漂移。使用硼砂和SDS组合缓冲液（曲线b）时，BPA在10.20 min处展现出良好对称性的峰，既能保证BPA主峰和杂质组分的完全分离，又具有平稳的基线。为保证样品完全溶解，在缓冲液中还加入少量的乙腈增加溶解性。因此，选择15 mmol/L 硼砂+15 mmol/L SDS 缓冲液（pH 9.0）为最优的CE运行缓冲液。

图5 CE测试电压与运行缓冲液条件优化

2.4 SPE小柱分析性能

在最优的SPE萃取条件下用所制备的石墨烯小柱分别对不同质量浓度（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μg/mL） 的 50 mL BPA标准溶液进行萃取富集并加热浓缩，最后用CE运行缓冲液定容到1 mL后进行CE测试。所得的CE色谱图如图6(a)所示，所得标准曲如图6(b)曲线a所示。作为对比，商品化的SupercleanTMLC-18 SPE 小柱（500 mg）富集后检测和CE直接检测的线性关系如图6(b)曲线b和曲线c所示。三种方法的线性关系分别为：

图6 不同浓度BPA经石墨烯基SPE小柱富集后CE检测图与BPA检测线性关系图

曲线a：ABPA=9 955.17CBPA+16 371.84 （r2=0.992 1），线性范围：0.05～80 μg/mL，检出限为0.02 μg/mL (S/N=3σ)；

曲线b：ABPA=5 059.32CBPA+5 580.18（r2=0.998 0），线性范围：0.50～80 μg/mL，检出限为 0.23 μg/mL(S/N=3σ)；

曲线c：ABPA=496.63CBPA+658.50（r2=0.998 9），线性范围：4.10～80 μg/mL，检出限为 3.27 μg/mL(S/N=3σ)。

检测结果表明，相比于商品化的SPE小柱，所制备的石墨烯基SPE小柱具有更宽的线性范围和更低的检出限。同时，由于所制备的石墨烯基SPE小柱的装柱量为30 mg，远低于商品化SPE小柱的500 mg的装柱量，因此所制备的石墨烯基SPE小柱具有更大的柱容量。这主要归功于石墨烯纳米材料极高的比表面积及其大π共轭结构，可以极大提升BPA在其上的吸附量。由上述结果可知，所制备的石墨烯基SPE小柱具有出更加优异的固相萃取效果。

2.5 方法的准确度和精密度

为验证所建立的石墨烯基SPE小柱-毛细管电泳联用方法的准确度和精密度，分别进行了3个浓度的加标回收率实验。如表2所示，BPA回收率在95.67%～109.50%范围内，表明所建立的联用方法可以实现BPA的准确和精密检测。

表2 方法的稳定性和精密度（n=3）

2.6 奶嘴中BPA测定

自本地超市中购买某品牌婴儿用奶嘴样品数只，采用甲醇超声提取和纯水回流提取两种方法提取其中的BPA。具体过程如下：1）甲醇超声提取。取1只奶嘴样品剪成2 mm×2 mm碎片，准确称取其质量为2.667 4 g。将样品置于50 mL烧杯中，加20 mL甲醇于超声下提取1.5 h后用所建立的联用方法测定其中的BPA。2）纯水回流提取。取10只奶嘴样品剪成2 mm×2 mm碎片，准确称取质量为27.014 0 g。将样品置于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL的去离子水，加热回流2 h后用所建立的联用方法测定其中的BPA。两种方法测定BPA的CE图如图7所示。将BPA峰面积代入标准曲线，可得每只奶嘴用甲醇超声提取时的BPA的迁移量为0.004 62 mg/1 000 mL，用纯水回流提取时的峰面积极低，未检出。根据欧盟最新法规（EU 2018/213），要求与食品接触的塑料制品中双酚A迁移限量不得超过0.05 mg/1 000 mL（水），并且婴幼儿用塑料制品中不得迁移出双酚A。由于本试验中两种提取方法均为极端情况下的结果，因此，所购买的婴儿用奶嘴质量完全符合相关标准。

图7 两种提取方法对商品化奶嘴样品中BPA的检测

3 结束语

本研究制备了高比表面积的石墨烯为吸附剂的固相萃取小柱，建立了SPE-CE联用方法用于婴儿奶嘴中痕量双酚A的检测。在最优的实验条件下，经与商品化的SPE小柱对比，所构建的SPE-CE联用分析方法对BPA表现出良好的线性关系和较低的检出限。通过甲醇超声提取和纯水回流提取两种方法对婴儿奶嘴实际样品中痕量BPA进行提取后用所构建的SPE-CE联用分析方法进行测定，该方法表现出良好的准确性和精密度，可实现实际样品中痕量BPA的高灵敏快速检测。本文所构建的联用方法为食品接触材料中痕量组分的分析检测提供了可行的思路，具有较好的应用前景。