β-胡萝卜素对青年母兔生长性能、抗氧化能力、生殖激素指标及卵泡发育的影响

孙 磊 刘艳华 王志刚 陈宝江,

(1.河北农业大学动物科技学院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，保定071000)

近年来，随着抗生素的禁用，越来越多的植物源性添加剂被应用到家兔饲粮中，发挥着抗菌、抗氧化以及改善生长性能和繁殖性能的作用[1-3]。β-胡萝卜素作为一种天然的类胡萝卜素，存在于多种植物中，不仅被广泛应用于人类食品以及化妆品中，也在动物饲粮中广泛应用[4]。β-胡萝卜素具有多个双键，在光、热、氧气及活泼性较强的自由基离子存在的条件下易氧化，可有效预防DNA和脂蛋白的氧化损伤，维持细胞功能，延缓机体衰老。研究表明，1分子β-胡萝卜素可抑制1 000分子的活性氧[5]。此外，β-胡萝卜素还与动物妊娠时合成和分泌孕酮(PROG)的过程有关。缺乏β-胡萝卜素而导致的黄体细胞PROG分泌减少的现象能通过补充β-胡萝卜素而得到改善，但增加维生素A的补充量则不能起到改善作用[6]。β-胡萝卜素作为黄体的组成成分，可以进入卵泡液转化为维生素A，调节生殖活动，促进黄体生成生殖激素，从而调节动物的繁殖能力[7]。资料显示，国内外关于β-胡萝卜素应用的报道主要集中于猪和牛，如梁宁等[8]和冯俊[9]研究发现，β-胡萝卜素能够显著提高母猪繁殖性能，并且在每个繁殖阶段起到了不同的作用。王波[7]和孙胜祥[10]研究表明，饲粮中添加β-胡萝卜素能够提高奶牛生产性能，降低繁殖疾病的发病率。β-胡萝卜素在家兔生产中应用的报道极少，贾福昌等[11]研究发现，饲粮中添加40 mg/kg β-胡萝卜素可以提高6周龄新西兰兔增长速度，降低料重比。因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对青年母兔生长性能、抗氧化能力、生殖激素指标及卵泡发育的影响，为β-胡萝卜素在家兔生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲养管理

动物试验于2020年12月至2021年1月于保定市唐县华益兔业养殖基地进行。选取55～60日龄、体重[(1.679±0.114) kg]相近、健康状态良好的雌性伊拉肉兔160只，随机分为4组，每组20个重复，每个重复2只。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加15(Ⅰ组)、30(Ⅱ组)、45 mg/kg(Ⅲ组)β-胡萝卜素。预试期7 d，正试期28 d。整个试验期肉兔自由采食和饮水，以重复为单位单笼饲养，保证光照和通风。

1.2 试验饲粮

以玉米、小麦麸、豆粕为主要原料，参照谷子林等[12]推荐的营养需要配制基础饲粮，其组成及营养水平见表1。各组饲粮均制成直径×长度为4 mm×10 mm的颗粒料。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

试验期开始和结束时，以重复为单位称量各组试验兔的体重，获得初始体重(IBW)和终末体重(FBW)，计算平均日增重(ADG)，计算公式如下：

ADG=(FBW-IBW)/试验天数。

1.3.2 样品采集

分别于试验第14和28天，每组随机选取6只试验兔采集血液，得到血清样品，-20 ℃保存，用于测定血清抗氧化和生殖激素指标。试验第28天，每组随机选取6只试验兔进行屠宰，取右侧卵巢样品，-80 ℃保存，用于测定卵巢抗氧化和生殖激素指标。取左侧卵巢样品，经生理盐水冲洗干净后，放入10%多聚甲醛溶液中，用于测定卵巢组织形态。

1.3.3 抗氧化指标

利用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清和组织匀浆后的卵巢样品中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T-AOC)，ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所，参照内置说明书进行检测。

1.3.4 激素指标

利用ELISA法测定血清和组织匀浆后的卵巢样品中的促黄体激素(LH)、促卵泡素(FSH)、雌二醇(E2)、PROG含量，ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所，参照内置说明书进行检测。

1.3.5 卵巢组织形态

固定卵巢组织，经脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片后采用Pannoramic 250数字切片扫描仪进行图像采集，采用Panthera数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，先于40倍下观察全部组织，观察大体病变，然后采集40倍和200倍图片，记录并计算原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡和黄体比例。

1.4 数据统计与分析

试验数据利用Excel 2010进行整理和初步计算，再利用SPSS 25.0一般线性模型(GLM)进行多因素方差分析，统计模型中包括时间、添加水平和时间×添加水平。单个因素间的比较则利用SPSS 25.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较。数据以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 β-胡萝卜素对青年母兔生长性能的影响

由表2可知，饲粮中添加β-胡萝卜素对青年母兔FBW和ADG均无显著影响(P>0.05)。

表2 β-胡萝卜素对青年母兔生长性能的影响

2.2 β-萝卜素对青年母兔抗氧化功能的影响

2.2.1 β-萝卜素对青年母兔血清抗氧化指标的影响

由表3可知，试验第14天时，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ组血清SOD活性显著升高(P<0.05)。试验第28天时，与对照组相比，Ⅰ组血清GSH-Px活性显著升高(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ组血清SOD活性显著降低(P<0.05)。添加水平对血清GSH-Px活性有显著影响(P<0.05)，添加水平为15和30 mg/kg血清GSH-Px活性显著高于添加水平为0和45 mg/kg(P<0.05)。时间对血清SOD活性有显著影响(P<0.05)，第28天血清SOD活性显著高于第14天(P<0.05)。添加水平和时间的互作效应对血清SOD、GSH-Px活性以及MDA含量有显著影响(P<0.05)。

表3 β-胡萝卜素对青年母兔血清抗氧化指标的影响

2.2.2 β-萝卜素对青年母兔卵巢抗氧化指标的影响

由表4可知，饲粮中添加β-胡萝卜素对青年母兔卵巢SOD、GSH-Px活性和T-AOC及MDA含量均无显著影响(P>0.05)。

表4 β-胡萝卜素对青年母兔卵巢抗氧化指标的影响

2.3 β-胡萝卜素对青年母兔生殖激素指标的影响

2.3.1 β-胡萝卜素对青年母兔血清生殖激素指标的影响

由表5可知，试验第14天时，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清LH含量显著升高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ组血清FSH含量显著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ组血清E2和PROG含量显著提高(P<0.05)。试验第28天时，与对照组相比，Ⅰ组血清E2含量显著提高(P<0.05)。添加水平对血清LH、FSH和E2含量有显著影响(P<0.05)。添加水平为15 mg/kg血清LH含量显著高于添加水平为0、30、45 mg/kg(P<0.05)，添加水平为15 mg/kg血清FSH含量显著高于添加水平为0、45 mg/kg(P<0.05)，添加水平为15、45 mg/kg血清E2含量显著高于添加水平为0、30 mg/kg(P<0.05)。时间对血清FSH、E2和PROG含量有显著影响(P<0.05)。第28天血清FSH、E2和PROG含量显著高于第14天(P<0.05)。添加水平和时间的互作效应对血清LH、E2和PROG含量有显著影响(P<0.05)。

表5 β-胡萝卜素对青年母兔血清中生殖激素指标的影响

2.3.2 β-胡萝卜素对青年母兔卵巢生殖激素指标的影响

由表6可知，饲粮中添加β-胡萝卜素对青年母兔卵巢LH、FSH、E2和PROG含量均无显著影响(P>0.05)。

表6 β-胡萝卜素对青年母兔卵巢生殖激素指标的影响

2.4 β-胡萝卜素对青年母兔卵泡发育的影响

由图1可知，与对照组相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组卵巢中原始卵泡比例显著降低(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ组卵巢中初级卵泡比例显著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ组卵巢中次级卵泡和成熟卵泡比例显著提高(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组卵巢中黄体比例显著提高(P<0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 β-胡萝卜素对青年母兔生长性能的影响

β-胡萝卜素是广泛存在于植物中的一种天然类胡萝卜素，是维生素A的前体物质[13]。有研究发现β-胡萝卜素应用于动物饲粮中可以对其生长起到积极作用[14-15]，但也有研究表明其促生长作用较小。杨旭[16]研究发现，饲粮中添加β-胡萝卜素育成牛对ADG无显著影响。毕宇霖等[17]研究发现，饲粮中添加不同水平β-胡萝卜素对肉牛FBW、ADG和干物质采食量均无显著影响。本试验结果表明，饲粮中添加β-胡萝卜素对青年母兔FBW、ADG均无显著影响，这可能是由于本试验所添加的β-胡萝卜素在青年母兔体内主要发挥了维生素A前体作用，对生长的直接促进作用不明显。

3.2 β-胡萝卜素对青年母兔抗氧化能力的影响

抗氧化酶类是动物抗氧化系统的重要组成部分，一般认为能反映机体抗氧化能力的指标有SOD、GSH-Px活性和MDA含量以及T-AOC[18-19]。β-胡萝卜素是有效的抗氧化剂，可以通过提高机体抗氧化酶活性，减少体内的自由基，提高机体抗氧化能力[20]。孙志英等[21]研究发现，给小鼠灌喂10 mg/kg β-胡萝卜素28 d后，其血清和肝脏GSH-Px活性显著增加；韩磊等[22]研究发现，给小鼠补充4.28 mg/kg β-胡萝卜素可以提高其血清GSH-Px活性，降低血清MDA含量；刘明美等[23]研究发现，在山羊饲粮中添加82.5 mg/d β-胡萝卜素，可以提高山羊血清GSH-Px活性和T-AOC，降低血清MDA含量。本试验结果表明，饲粮中添加15和30 mg/kg β-胡萝卜素均显著提高了青年母兔血清GSH-Px活性量，与上述研究结果一致，说明饲粮中添加β-胡萝卜素可以提高肉兔抗氧化能力。这可能是由于β-胡萝卜素通过触发核因子E2相关因子2(Nrf2)“开关”，激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)通路，增加抗氧化酶基因的表达量[24]。而且，Rocha等[25]试验证明，β-胡萝卜素可以改变谷胱甘肽-S-转移酶等抗氧化酶的活性。

3.3 β-胡萝卜素对青年母兔生殖激素指标的影响

动物的生殖活动受到多种生殖激素共同调控，一般认为，动物体内LH、FSH、E2和PROG含量可以反映其生殖激素的水平，进而反映其生殖力的高低。FSH和LH分泌主要受促性腺激素释放激素(GnRH)调控，FSH和LH可以促进卵巢分泌E2并排卵。E2则可以刺激垂体来调控FSH与LH的分泌。动物排卵后，黄体分泌大量PROG，PROG与E2共同作用会促使母畜发情，大量的PROG则会抑制发情[26-27]。β-胡萝卜素一方面可以进入卵泡内，直接调控激素分泌；另一方面β-胡萝卜素良好的抗氧化作用可以保护卵巢颗粒细胞的完整性，从而有助于激素分泌[28]。Ulziisaikhan[29]研究发现，饲粮中添加β-胡萝卜素可以提高奶牛血清LH、PROG、FSH和E2含量；李超[30]研究发现，饲喂不同水平β-胡萝卜素对奶牛血清E2和LH含量影响显著；刘锐钢等[31]在妊娠后期母猪饲粮中添加微囊化β-胡萝卜素，发现母猪血清E2和PROG含量显著提高。本试验研究证实，饲粮中添加β-胡萝卜素提高了青年母兔血清LH、FSH以及E2含量，说明β-胡萝卜素可以促进肉兔生殖激素的分泌，同时添加水平和时间具有互作效应。这可能是由于β-胡萝卜素可以随血液进入卵泡内，发挥了维生素A的作用，提高了黄体内类固醇水平，改善子宫环境，从而促进了激素分泌[32]。本试验结果发现，饲粮中添加β-胡萝卜素对青年母兔卵巢生殖激素含量没有显著影响，但影响了血清生殖激素含量，可能是受GnRH脉冲式分泌的影响[26-27]，但具体机理还有待探究。

3.4 β-胡萝卜素对青年母兔卵泡发育的影响

β-胡萝卜素可以通过调节激素分泌来促进卵泡发育。Kawashima等[33]研究发现，给干奶期荷斯坦奶牛补充β-胡萝卜素可以提高其优势卵泡比例。李梓妍[34]研究发现，奶牛饲粮中添加β-胡萝卜素能够提高发情表现，促进卵泡发育及成熟，减少受配次数。Yu等[35]研究发现，利用β-胡萝卜素作为抗氧化剂能够提高卵母细胞质量。本试验结果表明，饲粮中添加β-胡萝卜素显著降低了青年母兔卵巢中原始卵泡比例，提高了青年母兔卵巢中初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡和黄体比例，这说明饲粮中添加β-胡萝卜素可以加快卵泡发育过程，促进卵泡成熟。在卵泡发育过程，促性腺激素(FSH和LH)可以促进卵泡发育，诱导卵泡排卵、黄体生成[36]。β-胡萝卜素一方面作为抗氧化剂，保护卵泡细胞的完整性和活力；另一方面作为黄体固有成分，促进生殖激素的分泌。因此，机体促性腺激素含量升高，卵泡发育得到促进[37]。

4 结 论

① 饲粮中添加β-胡萝卜素可以提高血清GSH-Px活性，从而改善青年母兔的抗氧化能力。

② 饲粮中添加β-胡萝卜素可以通过促进LH、FSH和E2分泌，促进卵泡发育，进而改善青年母兔的繁殖力。

③ 本试验条件下，青年母兔饲粮中β-胡萝卜素适宜添加水平为30 mg/kg。