苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵参数的影响

田 旭 侯振平 玉 霞 张雪蕾 龙 云 龙 亮 王 荣 王 敏 吴端钦*

(1.中国农业科学院麻类研究所，长沙410205；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙410125；3.湖南德农牧业集团有限公司，湘西416144)

近年来，随着我国居民收入和生活水平的不断提高，人们对风味独特且富含蛋白质的牛、羊肉需求量逐渐增加[1]。在新冠肺炎疫情影响下，我国牛、羊肉消费产业虽然受到了影响，但消费仍然保持增长。统计数据显示，2020年我国牛肉进口量和消费量分别高达211.93万和951.50万t，同比增长分别为27.70%和3.05%[2]。随着我国牛、羊肉消费需求的持续增长，预计到2030年我国牛、羊肉消费总量将达到1 987万t，且难以依靠国际市场满足[3]。因此，大力促进我国草食畜牧业发展势在必行。然而，由于我国牧草产品产量不足且品质参差不齐，以苜蓿为代表的优质蛋白质饲草资源长期短缺，致使我国草食畜牧业高效发展受到极大制约。因此，合理利用非常规饲料资源、积极挖掘潜在的优质饲草资源、开发新的优质蛋白质饲草资源，可以从根本上解决困扰我国草食畜牧业发展的草畜不平衡问题。

苎麻(BoehmerianiveaL. Gaudich.)为荨麻科(Urticaceae)，苎麻属，多年生宿根性草本植物。其生态适应性强，生物产量高，粗蛋白质含量达22%左右，氨基酸种类丰富，是一种具有巨大开发潜力的蛋白质饲草资源[4]。目前，关于饲用苎麻与紫花苜蓿等优质蛋白质饲草组合使用的研究已经取得一定进展，奶牛饲粮中33%～67%的青贮苎麻替代苜蓿干草，对奶牛的生产性能和血清生化指标无不良影响[5]。10%～20%的饲用苎麻和稻草混合青贮替代紫花苜蓿干草饲喂奶牛，改善了奶牛干物质消化率，显著提高了牛奶乳脂率和总干物质率[6]。此外，20%和40%的青贮苎麻替代云岭牛饲粮中的青贮玉米，不仅对其生长性能和健康状况无负面影响，还可显著降低血清尿素氮的含量，提高机体蛋白质利用率[7]。在山羊饲粮中，低于35%的饲用苎麻替代苜蓿干草对山羊生产性能、瘤胃发酵功能和瘤胃微生物区系无显著影响[8]。此外，在全混合日粮中添加20%的饲用苎麻饲喂山羊，对其生长性能和血液生化指标均无不良影响，还可提高山羊肉多不饱和脂肪酸比例，改善肉品质[9]。

目前，关于苎麻和苜蓿组合对体外模拟瘤胃发酵特性的相关研究报道较少。因此，本试验旨在利用体外模拟瘤胃发酵技术，探究苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵参数的影响，筛选苎麻与苜蓿在畜牧生产中的合理配比，为实际生产中饲用苎麻与苜蓿科学配制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用种植于中国农业科学院麻类研究所沅江试验基地的“中饲苎1号”苎麻和紫花苜蓿作为试验材料。苎麻收割于2019年8月，株高100～120 cm，高度为80～100 cm。收割后利用揉丝机将苎麻与苜蓿分别切碎至2 cm左右，65 ℃烘干，粉碎过1 mm筛。将苎麻与苜蓿按不同质量[干物质基础(DM)]比例(10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和90∶10)混合均匀作为发酵底物，保存于密封袋中备用。发酵底物干物质、粗蛋白质(CP)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)含量参照AOAC(2005)[10]的方法测定。中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参照Van Soest等[11]的滤袋法测定。总能(GE)采用等温式全自动热量仪(5E-AC8018，长沙开元仪器有限公司)测定。

1.2 试验动物及饲粮

选取3只体重[(25.0±2.0) kg]相近且安装永久性瘤胃瘘管的健康成年湘东黑山羊作为瘤胃液供体动物，单笼饲养，自由饮水。饲粮精粗比为50∶50，其中粗饲料为稻草，精饲料组成为玉米47.00%、豆粕24.00%、麦麸22.00%、食盐0.77%、石粉2.23%和预混料4.00%。整个试验期内，每天饲喂精饲料和稻草各300 g(干物质基础)，每日饲喂2次(08:00和18:00)。

1.3 体外发酵

参照Menke等[12]的方法配制人工瘤胃缓冲液2 000 mL，配制好后持续通入纯二氧化碳(CO2)以确保溶液厌氧环境，然后于39.5 ℃恒温水浴锅中预热备用。试验当天晨饲前采集瘤胃内容物，用6层脱脂纱布过滤500 mL瘤胃液与人工瘤胃缓冲液混合，制成混合人工瘤胃培养液。在此过程中，采用恒温磁力搅拌器持续搅拌，温度恒定在39.5 ℃，并不断通入CO2保持厌氧环境。

参照Wang等[13]的方法，利用全自动化体外模拟瘤胃发酵系统进行体外发酵试验。精确称取0.6 g发酵底物于150 mL厌氧发酵瓶中，置于39.5 ℃的恒温培养箱中预热2 h，接种前向厌氧发酵瓶中通入CO2以保证发酵瓶中为厌氧环境。最后用瓶口分液器迅速向每个发酵瓶中加入事先预热好的人工瘤胃培养液60 mL，并立即盖严瓶塞。将发酵瓶转移至39 ℃恒温培养箱培养48 h后终止发酵。发酵瓶通过导管与三通电磁阀和压力传感器连接。压力传感器与计算机连接，实时测定并记录瓶中压力，通过压力与气体体积间关系计算气体生成量。当发酵瓶中压力超过9 kPa，三通电磁阀在计算机控制下自动打开，厌氧瓶中顶部空间的气体释放并进入气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)，从而对气体中的氢气和甲烷产量进行测定[14]。产气参数、氢气和甲烷产量参考Wang等[15]的方法进行计算。每个发酵瓶为1个平行，每次试验的每个处理和空白均设置3个平行，重复体外发酵试验3次，每次试验使用的瘤胃液来自2只不同瘘管羊。

1.4 样品采集与测定

48 h体外模拟瘤胃发酵试验结束后，用高精度便携式pH计(S210，Mettler Toleddo，上海)测定发酵液的pH。取5 mL发酵液，在4 ℃条件下离心10 min(15 000×g)，取1.5 mL上清液，加入0.15 mL 25%(质量体积比)的偏磷酸固定，静置15 min后，在-20 ℃条件下保存过夜。参考Wang等[16]方法测定总挥发性脂肪酸及各组分浓度。采用300目纱布过滤离心管中剩余发酵底物，用蒸馏水漂洗剩余底物至水清后，置于105 ℃条件下烘干至恒重，参照程景等[17]方法，计算干物质降解率。

1.5 数据分析

应用非线性软件(NLREG 5.4[18])程序，计算不同时间点的产气参数；按照下面的公式计算最大产气量及起始底物降解速率(FRD0)等参数[19-20]：

GPt=Vf[1-exp(-kt)]/[1+exp(b-kt)]；
FRD0=k/[1+exp(b)]。

式中：GPt为t时间点底物的累积产气量(mL)；Vf为潜在最大产气量(mL)；k为产气速率(h-1)；b为曲线的形状参数。

用Excel 2010记录数据并做初步处理，采用SPSS 23.0软件中的一般线性模型程序对数据进行方差分析，通过Duncan氏法对各组平均值作多重比较，使用正交多项式比较分析各个指标随苎麻和苜蓿组合比例变化的趋势。以P<0.05作为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 苎麻和苜蓿组合常规营养成分含量

由表1可知，不同比例的苎麻和苜蓿组合后，发酵底物中干物质含量在91.12%～92.60%，粗蛋白质含量在22.15%～22.97%，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗灰分含量均随苎麻比例的增加而升高，粗脂肪含量和总能随着苎麻比例的增加而降低。

表1 苎麻和苜蓿组合的常规营养成分(干物质基础)

2.2 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵产气参数的影响

由图1可知，苎麻与苜蓿组合的总产气量和产气速率存在差异。由表2可知，干物质降解率、每克底物的产气量、降解每克底物的产气量、产气速率和起始底物降解速率随苎麻比例的增加呈显著线性降低(P<0.05)。与苎麻比例≤20%相比，当苎麻比例≥30%时，底物干物质降解率显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥40%时，每克底物的产气量和产气速率显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥70%时，降解每克底物的产气量显著降低(P<0.05)。

图1 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵总产气量和产气速率的影响

表2 苎麻和苜蓿组合对48 h体外瘤胃发酵参数的影响

2.3 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵氢气和甲烷生成的影响

由表3可知，苎麻与苜蓿组合每克底物的氢气产量、氢气潜在最大产量、降解每克底物的氢气产量和氢气产生速率均随苎麻比例的增加呈显著线性升高(P<0.05)。与苎麻比例≤20%相比，当苎麻比例≥70%时，氢气潜在最大产生量和降解每克底物氢气产量显著升高(P<0.05)；当苎麻比例≥80%时，氢气产生速率显著升高(P<0.05)。

每克底物的甲烷产量、降解每克底物的甲烷产量和甲烷产生速率均随苎麻比例的增加呈显著线性降低(P<0.05)。与苎麻比例≤20%相比，当苎麻比例≥30%时，每克底物的甲烷产量显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥40%时，甲烷潜在最大产量和降解每克底物的甲烷产量显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥60%时，甲烷的产生速率显著降低(P<0.05)。

2.4 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸组成的影响

由表4可知，苎麻和苜蓿组合体外发酵结束后，发酵液pH介于6.68～6.79，各组合比例之间差异不显著(P>0.05)。总挥发性脂肪酸浓度、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸比例均随苎麻比例的增加呈显著线性降低(P<0.05)，乙酸比例和乙丙比随苎麻比例的增加呈显著线性升高(P<0.05)。与苎麻比例≤20%相比，当苎麻比例≥50%时，总挥发性脂肪酸浓度和异丁酸比例显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥70%时，丁酸比例显著降低(P<0.05)；当苎麻比例≥80%时，乙酸比例和乙丙比显著升高(P<0.05)，而丙酸和异戊酸的比例显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵参数的影响

饲粮经瘤胃微生物发酵后产生CO2、氢气和甲烷等气体，其体外模拟瘤胃发酵的产气量和降解率已成为衡量饲粮可发酵程度的重要指标[21]。饲粮中所含非结构性碳水化合物与结构性碳水化合物相比更易被微生物分解利用，因此，当饲粮富含非结构性碳水化合物时，其体外发酵的产气量和降解率也更高[7]。在本试验中，随着苎麻比例的增加，体外发酵产气量和产气速率呈现线性降低。这是因为与紫花苜蓿相比，饲用苎麻的非结构性碳水化合物含量较低，结构性碳水化合物含量较高，而后者瘤胃降解率低于前者。阳伏林等[22]研究得出，不同比例的小麦秸秆与苜蓿干草体外发酵总产气量随小麦秸秆比例的增加而降低。这与本试验结果相似。当苎麻比例低于30%时，总产气量和产气速率无显著变化，这表明苎麻比例低于30%时，对体外瘤胃发酵不会产生负面影响。干物质降解率与饲粮中可发酵碳水化合物含量和体外发酵产气量具有高度相关性[23]。在本试验中，干物质降解率与总产气量变化趋势一致，当苎麻比例低于20%时，干物质降解率没有显著变化，但随着苎麻比例的增加，干物质降解率呈现线性降低。这表明饲粮中苎麻添加比例较高时，对体外发酵具有一定的抑制作用，这可能是因为苎麻粗纤维含量较高[5]。许兰娇等[24]利用尼龙袋法研究发现，不同比例苎麻和象草混合青贮，瘤胃干物质降解率随苎麻比例的增加而降低。这与本试验研究结果相一致。

3.2 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵氢气和甲烷生成的影响

饲粮可发酵碳水化合物在瘤胃微生物的作用下生成挥发性脂肪酸的过程中往往伴随着氢的产生，反刍动物为维持瘤胃内氢分压的稳定，瘤胃内甲烷菌会将氢气转化为甲烷排出体外[25]。反刍动物瘤胃甲烷排放不仅造成了饲粮能量的损失，同时也加剧了温室效应。

研究表明，不同粗饲料组合对反刍动物瘤胃发酵和甲烷的排放具有调节作用，其主要是通过提高饲粮非结构性碳水化合物比例，降低中性洗涤纤维比例，瘤胃发酵模式由乙酸型向丙酸型转变[26]，饲粮在发酵生成乙酸过程中，会释放大量的氢，而在生成丙酸的过程中，会竞争性利用甲烷菌所需的氢，从而降低甲烷排放[27]。在本试验结果中，随着苎麻比例的增加，发酵底物的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均增加，每克底物甲烷产量、甲烷潜在最大产量和甲烷产生速率均呈现线性降低。这可能是与苎麻比例过高抑制底物发酵有关。然而，降解每克底物甲烷的产量也呈现线性降低，这说明甲烷生成过程受到了抑制。有研究结果表明，苎麻含有单宁和黄酮类化合物，其中苎麻单宁酸含量在0.6%左右，不同品种和茬次的苎麻虽存在一定差异，但均显著高于紫花苜蓿[28]。此外，在苎麻根中黄酮类化合物含量为0.51%，韧皮中为1.77%，而叶中达2.74%[29]。单宁和黄酮类化合物可对甲烷菌产生直接的抑制作用，减少甲烷菌对氢气的利用，从而减少甲烷产生[30-31]。

3.3 苎麻和苜蓿组合对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸组成的影响

瘤胃液pH是影响瘤胃微生物生长代谢的重要因素，更是反映瘤胃发酵状况的关键指标。在本试验中，各组合发酵液pH介于6.68～6.79，均在适宜范围内，表明人工瘤胃缓冲液配制合理，达到了维持体外发酵环境稳定的作用。研究表明，瘤胃发酵类型和挥发性脂肪酸浓度及组成主要由饲粮非结构性碳水化合物和中性洗涤纤维比例决定[32]。在本试验中，随苎麻比例的增加，总挥发性脂肪酸浓度、丙酸和丁酸比例呈现线性降低，乙酸比例和乙丙比呈线性升高。这主要是因为苎麻比例的增加导致发酵底物中非结构性碳水化合物含量降低，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量增加，促使更多的乙酸生成。Gao等[6]采用饲用苎麻和稻草混合青贮后，以10%～20%的比例替代紫花苜蓿干草饲喂奶牛，结果发现苎麻添加对瘤胃总挥发性脂肪酸浓度和组成无显著影响。同样，Du等[33]研究也表明，低于20%的苎麻替代苜蓿对山羊瘤胃总挥发性脂肪酸浓度和组成无显著影响，这与本试验结果相一致[6,33]。此外，苎麻与苜蓿以20∶80组合时，总挥发性脂肪酸浓度和乙酸比例最高，这表明在本试验条件下苎麻与苜蓿以20∶80组合更有利于饲粮发酵。异丁酸和异戊酸均属异构酸，瘤胃内异构酸主要来源于粗蛋白质降解成氨基酸后在微生物作用下经氢化脱氨基或脱羧基后的产物[34]。本试验中，异丁酸和异戊酸比例随苎麻比例的增加而降低。这可能是因为随着苎麻比例的增加提高了底物中单宁含量提高，进而抑制了微生物对粗蛋白质的降解，导致氨基酸分解减少，异丁酸和异戊酸比例降低[35]。

4 结 论

在本试验条件下，当苎麻比例≤20%时，对体外模拟瘤胃发酵和底物降解影响较小，并且对甲烷生成具有抑制作用；本研究结果提示，生产中苎麻替代苜蓿饲喂反刍动物时其比例不宜超过20%。