利用诊断超声增强肿瘤放化疗和免疫治疗疗效的研究进展*

刘政 屠娟 黄蕾丹 董小小 李泞珊

放化疗是临床大多数恶性肿瘤的首选和主要治疗方法，而免疫治疗则是当今最具发展前景的新兴治疗方法。然而，在这些治疗中肿瘤常产生治疗抵抗，严重影响了治疗疗效[1-3]。近年来，低强度超声治疗作为一种新的肿瘤治疗抵抗的解决方法，正在受到业界的关注。

虽然超声影像诊断在临床广泛应用，但超声的治疗作用一直是超声医学领域研究的重要方向[1]。低强度超声一般指平均声强（ISPTA）低于3 W/cm2的聚焦式或非聚焦式治疗超声，采用单晶片或多晶片相控阵超声换能器。单晶片换能器聚焦范围小而固定，一般4 mm×2 mm，焦点声压高；多晶片相控阵换能器聚焦范围和形态可调，可变范围大。与高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）的热消融机制不同，低强度超声治疗机制主要以空化效应和机械效应为主，往往需要联合使用超声造影剂微泡（microbubble）来诱导增强空化效应，而热效应则需要避免，故也称为微泡介导的超声空化治疗方法[2，4]。

近年来，低强度超声用于肿瘤放化疗和免疫治疗增强的基础研究成果令人瞩目，具有安全无创、疗效显著、简便等特点，其治疗机制也逐渐明朗[2，5]。其中，因具有低强度超声输出的相控阵超声诊断仪广泛应用于临床，故直接采用超声诊断仪实施超声治疗成为可能，并已被初步尝试用于小样本临床研究[6]。

1 诊断超声的治疗机制

诊断超声的治疗原理与低强度超声治疗类似，但输出能量和声学参数更低,其平均声强ISPTA<720 mW/cm2、机械指数（mechanical index，MI）<1.9、热指数（thermal index，TI）<6.0，因此，诊断超声在组织中产生的热效应微小可忽略，其治疗机制以超声空化（cavitation）和机械效应为主。由于诊断超声采用多晶片相控阵换能器，聚焦范围及聚焦区声压可调（一般为0～3 MPa可调），并有实时影像监控的特点。

生物组织中通常含有很多的微小气核（如溶解的氧气），当超声传播且声压超过一定阀值时，这些气核会发生空化谐振膨胀生成空化泡。在超声作用下，空化泡会产生震荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列动力学过程，释放出辐射压力、冲击波、微射流等机械能量，在微血管壁或细胞膜上形成微小声孔（图1），即所谓声孔效应[7]（sonoporation），可能造成生物膜屏障通透性增高、甚至微小血管破坏和细胞凋亡等生物学效应。早期研究认为，在常用诊断超声频率范围（1～5 MHz），生物组织自发空化所对应的声压阈值较高，空化强度微弱，随机性强，不易控制，不适用于临床治疗。

近年来，一系列研究表明，造影剂微泡的应用赋予微泡精准调控声场能量的能力，将微泡作为空化核注入体内可显著降低空化阈值，高度聚集声能，大幅度提高声空化治疗效应；在较低声压（<0.3 MPa）驱动下，微泡产生较温和的稳态空化（stable cavitation），空化泡的周期性谐振会对附近细胞膜产生不断的推拉作用或声辐射压力，或激发声微流（microstreaming），进而在细胞膜上产生小于94纳米的声孔（图1）；当驱动声压较大时（通常>0.3 MPa），主要引发造影剂微泡的非线性惯性空化（inertial cavitation，亦称瞬态空化）行为。在此过程中，入射声能会被高度集中，伴随空化泡剧烈崩溃瞬间，在液体中的极小空间内释放出冲击波、微射流等机械能量，瞬间击穿周围的组织血管壁和细胞膜等生物屏障，惯性空化导致的细胞膜穿孔可能过大（2～4微米）而无法修复，进而引起细胞凋亡[7]。这些超声空化效应所产生的生物学效应在肿瘤化疗释药、放疗增敏、基因转染、开放血脑屏障和溶栓等众多领域具有多种治疗作用。

低强度超声治疗需要联合静脉注射超声造影剂微泡，这种微泡平均粒径为2～3 μm、微泡浓度为108～109/mL，其最佳谐振频率为2～3 MHz，与低频诊断超声频率符合。微泡在超声治疗中的作用不再是诊断作用，而是诱导空化效应的空化核治疗作用。

2 超声肿瘤血流效应

已知实体瘤的乏血供和乏氧状态是造成肿瘤放化疗和免疫治疗抵抗的一个重要原因[3]，而诊断超声治疗具有刺激实体肿瘤血流灌注明显增强的作用，即所谓“超声肿瘤血流效应（sononeoperfusion）”，可能是解决乏血供肿瘤治疗抵抗的一个新方法。

2.1 基础实验研究

前期实验发现，采用参数改进的诊断超声[参数设置：频率3～4 MHz、机械指数MI 0.25～0.30，脉冲重复频率（pulse repetition frequency，PRF）1kHz]联合静脉注射微泡治疗大鼠Walker-256肿瘤和兔VX2肿瘤10～20 min后，结果显示约80%的动物肿瘤血流灌注明显增强，灌注面积增大，对于乏血供肿瘤的效果尤为明显，部分缺血无灌注区重新获得血流灌注，可持续4 h以上[8-9]。研究还发现，从超声造影定量分析结果看，肿瘤血流量平均增加18%、平均血流灌注面积增加31%以上。肿瘤血流增强的机制，可能是因为微泡空化对微血管壁的机械刺激损伤，产生了炎症反应和多种炎性扩血管因子释放（图2），治疗后肿瘤组织的eNOs增加53.16%、NO增加28.80%、PGF2增加52.03%等。

2.2 临床研究

由于超声诊断仪和超声造影剂微泡均是临床常用的商品化医疗仪器和药品，因此，在伦理批准的情况下，进行了小样本乳腺癌[10]、胰腺癌和转移性肝癌[11]的超声化疗临床研究，治疗参数为：发射频率4 MHz，声压为0.3～0.6 MPa（对应MI值0.15～0.30），PRF 20 Hz，脉冲宽度18个周期，超声聚焦区大小为2.5～4.0 cm；治疗中匀速静脉注射（推注速率0.5 mL/min）SonoVue微泡一支。结果显示，超声治疗后乏血供肿瘤的血流灌注明显增强，具体表现为超声造影显示的肿瘤灌注面积增大、血流灌注强度增强（图3）。

3 超声化疗

3.1 基础实验研究

超声化疗（sonochemotherapy）的基础研究众多，涉及面广泛，包括超声化疗释药机制、热效应、机械效应、细胞内释药以及联合实施方法等[2]。尽管这些研究采用的仍然是低强度超声治疗仪，但其平均声强为22.57～2560 mW/cm2，声压在400 kPa～1.9 MPa，大部分参数均与诊断超声能量范围重叠，为利用诊断超声联合微泡实施低强度超声治疗提示了可能性。

超声增强肿瘤化疗的效果主要表现在以下方面[2]：增加肿瘤的化疗释药1.5～10倍不等；超声化疗产生的肿瘤生长抑制效应可以造成肿瘤体积下降2倍，其生存期一般显著高于单纯化疗。虽然诊断超声比一般治疗超声的声强更低，但仍然获得了较好结果，如诊断超声联合微泡不仅可在化疗时增强肿瘤血流灌注、提高肿瘤血管通透性，而且可增加至少两种动物肿瘤的局部化疗释药浓度，从而加强化疗对肿瘤的生长抑制和杀伤作用[8-9]。该研究中，诊断超声增强的化疗在MI仅0.25的情况下，显著提高了阿霉素对大鼠Walker-256肿瘤的局部释药3.12倍，且在组织分布更均匀；在兔VX2肿瘤模型中，也提高了阿霉素在肿瘤组织中的药物浓度2.63倍，并且显著抑制了肿瘤生长。上述结果充分说明，诊断超声可能具有与一般低强度治疗超声同样的治疗效应。

3.2 临床研究

近年诊断超声已经开始被尝试用于增强临床胰腺癌化疗，初步结果令人瞩目。Dimcevski等[6]研究采用诊断超声联合微泡用于失去手术机会的胰腺癌的吉西他滨单药化疗，为单中心、小样本回顾对照研究，其超声治疗参数频率为1.9 MHz，MI为0.2（声压0.27 MPa），脉冲宽度4个周期；治疗时推注SonoVue微泡0.5 mL/3.5 min，治疗时间共31.5 min；结果超声化疗显著延长10例胰腺癌患者的中位生存期（超声化疗组17.6个月，单纯化疗组8.9个月），超声化疗的周期数（13.8 ± 5.6）也比单纯化疗组（8.3 ± 6.0）明显提高，其中2例患者在超声化疗结束后重新获得了手术机会。本课题组也在国内完成了一项胰腺癌超声化疗随机对照临床研究（RCT）的入组和治疗，试验组采用经改进的诊断超声（参数：MI 0.2、脉冲宽度8.5个周期、PRF 2 kHz，治疗时推注SonoVue微泡1 mL/5 min，治疗时间共25 min）联合胰腺癌经典方案化疗（吉西他滨+白蛋白紫杉醇），对照组仅实施经典化疗，结果在试验还未达到终点的情况下，试验组的疾病控制率（DCR）显著优于对照组（69.2% vs. 40%），且试验组能耐受的化疗周期数高于对照组6.0个周期，以上临床研究中，均未发现超声化疗有增加化疗不良反应的风险。

4 超声放疗

4.1 基础实验研究

所谓超声放疗主要是通过超声刺激增加肿瘤血管内皮细胞对放疗的敏感性、促进细胞凋亡，达到增强低剂量放疗的目的[12-13]，产生该现象的主要机制是血管内微泡空化谐振的机械性刺激（如剪切力、微射流等），促进了内皮细胞合成神经酰胺（ceramide）。虽然内皮合成神经酰胺并不能直接克服肿瘤乏氧的放疗抵抗，但通过一种酸性神经磷脂酶（sphingomyelinase）诱导的神经酰胺依赖机制却显示出低于8 Gy的低剂量放疗有效杀伤肿瘤血管。

有学者对2-羟酰基鞘氨醇1-β-半乳糖基转移酶（UGT8）在调控超声放疗引起的细胞应激反应中的作用进行了研究。UGT8 的主要功能是通过转移尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）半乳糖基而合成半乳糖神经酰胺——一种抗凋亡分子。在免疫缺陷鼠中的研究发现，超声放疗可显著下调UGT8表达而达到放疗增敏效果，研究结论认为，超声对内皮细胞产生机械刺激，诱导神经酰胺进入细胞而促进细胞死亡，进而明确了神经酰胺和酸性鞘磷脂酶通过介导血管内皮损伤而实现放疗增敏的作用[14]。

目前，超声增敏放疗的方法已经在乳腺癌、膀胱癌、肝癌等多种肿瘤的动物模型中得到验证，展现出对2～8 Gy低剂量放疗的显著增敏效果，具有降低放疗不良反应的潜在意义[14]。尽管大多数基础研究中，超声治疗仍然采用聚焦式超声治疗仪，但是不论其声压（550～570 kPa）、脉冲宽度（16个周期）和PRF（3 kHz）均在低强度超声范畴，与诊断超声参数有重叠且非常接近。

4.2 临床研究

正因为超声放疗具有低强度超声治疗和对低剂量放疗增效的特点，最近有学者采用超声诊断仪联合微泡的方法实施临床超声放疗研究。首次超声放疗的临床研究应用于原发性肝癌患者（hepatocellular carcinoma，HCC）的钇-90微球放疗栓塞（transarterial radioembolization，TARE）治疗，研究采用临床常规的超声诊断仪和造影剂微泡，而超声治疗选用微泡击破模式（flash）进行，其频率为1.5 MHz，机械指数为1.13，PRF 100 Hz，脉冲宽度4个周期，联合Optison微泡（0.18 mL/min），治疗时间10 min，最后以mRECIST标准评价4～6个月后的疗效。结果显示，在针对28例HCC患者的随机对照研究（randomized controlled trial，RCT）中，超声放疗（共3次超声治疗）组患者获得了93%的客观缓解率，而对照组仅有50%（P<0.05，图4）[15]。通过肝功能等放疗相关的生化和血液检查，未发现超声放疗有增加不良反应的风险。

5 超声免疫治疗

近年来，超声空化治疗方法也在增强肿瘤免疫治疗方面凸显希望[16-17]。超声空化治疗技术，从理论上可作用于肿瘤免疫周期的多个环节[18]，从而增强免疫治疗疗效（图5）。其作用环节包括：1）直接机械性杀伤肿瘤细胞致抗原暴露，从而激活抗原提呈细胞，基于该理论的声压通常>3 MPa[19]；2）损伤肿瘤细胞，引起损伤相关分子模式（DAMPs）的表达，从而促进树突状（DC）细胞成熟；3）介导效应性T细胞归巢，如刺激趋化因子、细胞因子释放，从而募集效应性T细胞到达肿瘤微环境；4）声孔效应突破“血-肿瘤屏障”，包括改变血管状态、机械性扰动细胞外基质[20]，从而有利于效应性T细胞浸润。

虽然超声治疗的能量形式具有多样性，既有以热效应为主的HIFU、以高强度空化机械消融为主的组织毁损术（histotripsy），也有微泡介导的低强度超声空化治疗方法，而采用安全性更好的诊断超声激励微泡同样也产生了显著的治疗作用。有研究[21]发现，诊断超声联合微泡治疗产生的血流增强效应联合抗PDL1具有明显抗肿瘤疗效。具体表现在：增加了肿瘤中CD8+T细胞浸润数量，CFSE标记的活化CD8+T细胞数量为对照组的1.96倍（P<0.01）；增加了抗PDL1在肿瘤内的浓度；联合治疗有促进肿瘤血管正常化的趋势；最后，超声改善了肿瘤免疫治疗微环境。因此，超声血流增强效应可作为增效PD-L1抗体肿瘤免疫治疗的有效方法，目前超声肿瘤免疫治疗尚未见相关临床研究报道。

6 安全性研究

诊断超声和造影剂在临床应用分别有超过60年和20年的安全记录，在超声放化疗临床研究中也未发现有增加不良反应的风险[6，11]，但是，其增强肿瘤血流效应是否可能有促进肿瘤转移的风险是一个值得关注的问题。Zhang等[8]在采用兔VX2肿瘤模型的研究中，未发现超声化疗（阿霉素）有增加肺、脑、肝、肾等主要转移靶器官的肿瘤转移风险，超声化疗与单纯化疗之间比较转移评级差异无统计学意义（P>0.05）。其他类似研究也未发现诊断超声有增加小鼠黑色素瘤肺转移转移或结直肠癌脾转移的风险[21-22]。因此，诊断超声用于增强肿瘤化疗尚未发现有明显的不良反应。

7 针对超声治疗的仪器改进

利用诊断超声实施低强度超声治疗具有超声影像引导的先天优势，由于诊断和治疗脉冲是同一组换能器发射，诊疗信号完全同轴共面，故精准性有保证。

然而，一般超声诊断仪毕竟是为超声诊断设计制造的，虽然也可以用于超声治疗，但是在声学参数调控、声束聚焦和治疗可操作性方面都有不少困难和局限性。为了适应超声治疗，国外有研究将诊断仪的脉冲宽度增加到5～20 μs（8～30个周期），以提高对微泡空化谐振的效率，因为常规超声的脉冲非常短，仅有1～2个周期[23]。该研究对超声诊断仪的治疗改进相对丰富而完整，不仅增加了多个治疗参数调控设置（机械指数、脉冲宽度和脉冲重复频率等），而且还具有相控电子“弱聚焦”（即自适应可变焦域技术）、专用治疗操作界面和程序设置等，使之成为一台同时兼有超声空化治疗能力的超声诊疗一体机（图6）。该仪器采用了诊断和治疗脉冲相间发射的方式，信号互不干扰，又能够在超声影像引导下对病灶进行聚焦治疗。超声能量输出控制在诊断超声标准范围，肿瘤血流增强还可以通过仪器的造影功能实时评价。因此，该仪器可能成为实施低强度超声治疗较好的临床研究平台。

利用诊断超声增强肿瘤放化疗和免疫治疗是全新的领域，尚存在许多认识空白。不同肿瘤及部位的超声治疗参数可能不一样，今后更多将聚焦于肿瘤个性化治疗参数，针对不同肿瘤探索适宜的超声治疗参数组合。

综上所述，诊断超声增强肿瘤放化疗和免疫治疗不仅安全无创，至今尚未发现明显不良反应，而且还具备临床转化迅速的特点，是一个值得关注的新方法。