杨树MADS转录因子SVL基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

王冬莉，刘芸杉,2，孟 森，卞 展*

(1.中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520；2.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404100)

生长在北半球的杨树属(Populus)含有约30种植株，在温带树木中生长速度最快。相对较小的基因组、大量的分子遗传图谱和成熟的遗传转化体系使得杨树成为重要的林木模式植物。同时，杨树还可以生产各种木材产品(木材、纸浆和纸张)，具有保持水土、涵养水源等功能[1]。然而，在杨树整个生命过程中，非生物胁迫严重影响着杨树生长[2]。探究杨树抵御非生物胁迫的分子及生理机制具有重要的意义。

转录因子常在生物的发育或信号转导中发挥重要作用，MADS-box家族基因是其重要的组成部分[3]。MADS-box基因家族成员拥有保守的N端结构，由大约60个氨基酸组成，与CArG位点结合后参与下游信号途径[4]。目前，已有许多研究解析了不同物种的MADS基因的结构、表达、定位、蛋白基序组织及系统发育关系，比如西瓜(Citrulluslanatus)、苦荞麦(Fagopyrumtataricum)、杨树(Populustrichocarpa)、菊花(Chrysanthemumnankingense)、番茄(Solanumlycopersicum)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)[5-10]。许多重要的MADS-box转录因子决定花器官的形成、调节果实发育和胚胎发生。1990年，金鱼草的基因defA-1突变后，花瓣转化为萼片，雄蕊转化为心皮，植株表现出“球藻”的形态[11]。SOC1(Suppressor of Overexpression of Constants1)基因整合光周期、温度、激素和年龄等参与开花途径，同时受到2种拮抗开花调节剂CO(CONSTANS)和FLC1(Flowering Locus C1)的调控，它们分别作为花的激活因子和抑制因子[12]。拟南芥fruitfull基因突变后消除了受精后长角果伸长的表型[13]。AGL15可能是调控种子发育的重要组成部分[14]。植物MADS基因在应对非生物胁迫方面也发挥关键作用。比如，过表达SlMBP22后的番茄通过影响生长素、赤霉素信号影响植株的高度和叶片大小，且比野生型的番茄更耐干旱；脱水处理可以诱导SlMBP22基因表达[15]。SVP(Short Vegetative Pahse)在拟南芥中直接靶向细胞色素P450单加氧酶CYP707A1/CYP707A3和葡萄糖苷酶AtBG1控制脱落酸含量，进而抵御干旱胁迫[16]。目前，在杨树中已经克隆了有关MADS基因，但是多数集中在与花相关或营养器官相关的研究中，有关其应对非生物胁迫的研究欠缺[17-20]。

本研究以84K(Populusalba×Populusglandulosa'84K')杨树为试验材料，对杨树PtSVL(Short Vegetative Pahse-Like)进行了克隆，并纯化出融合蛋白，将融合蛋白作为抗原免疫新西兰公兔以获得多克隆抗体。使用抗体以期筛选出PtSVL潜在的互作蛋白，从而为探究PtSVL蛋白功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

将84K杨树培育在MS培养基中，幼苗高度达到8.5 cm左右时移植到土壤中(草炭土∶蛭石=3∶1)。在培养箱中(温度25 ℃；相对湿度75%；16/8 h光照/黑暗)生长2个月后，取叶片样品，液氮速冻后立即保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 PtSVL蛋白质结构分析及抗原性预测 PtSVL蛋白的亲/疏水性被ExPASy软件中的ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在线预测。Protean中的Jameson-Wolf方法被用来分析PtSVL蛋白的抗原指数等。

1.2.2PtSVL基因的克隆 依据杨树数据库PopGenIE (https://popgenie.org/)中Potri.007G010800序列设计用于扩增PtSVL基因的上游和下游引物。上游引物序列为PtSVL-F(ATGGCAAGAGAGAGGATTCAGA)，下游引物序列为PtSVL-R(TCAGTTTGAAAATGGCAACCCCA)，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。以84K杨树叶片cDNA为PCR模板，50 μL的PCR体系中含有2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix (10mM) 1 μL，cDNA 2 μL，SVL-F 2 μL，SVL-R 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL和ddH2O 17 μL。PCR程序设置为：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；53 ℃，15 s；72 ℃，15 s；运行35个循环后再经72 ℃、5 min；结束程序。

1.2.3 原核表达质粒构建 经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段大小处的条带。采用无缝克隆技术将基因链3×FLAG标签后连接到实验室保存的原核表达载体pET-B2M中，然后转入大肠杆菌B21(DH3)。挑取阳性克隆在至LB培养基中37 ℃震荡培养，提取质粒后利用PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，并送至睿博兴科测序。

1.2.4 目的蛋白小量表达与鉴定 在3 mL液体LB中加入pET-B2M-SVL-3×FLAG重组质粒的单菌落，在37 ℃摇床中培养至浓度(OD600)约为0.6。取适量菌液作为对照，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度0.5 mmol·L-1)作试验组，37 ℃摇床培养4 h。取对照组和试验组各0.15 mL，12 000 r·min-1离心2 min。取40 μL 1×loading buffer重悬裂解菌体沉淀，SDS-PAGE检测上清液。

1.2.5 蛋白大量表达、破菌检测 在100 mL液体LB中加入100 μL原保存于-20 ℃的菌种，过夜培养。随后将菌液接种于2 L LB液体培养基中，37 ℃培养至浓度(OD600)约0.6。加入诱导剂IPTG至其终浓度为0.5 mmol·L-1，30 ℃震荡培养4 h。8 000 r·min-1离心3 min收集菌体后用50 mL预冷NTA-0缓冲液重悬菌体，冰浴30 min。使用功率200 W、工作3 s、暂停4 s的超声破碎菌体25～30 min。16 000 r·min-14 ℃离心50 min，收集上清以及沉淀。SDS-PAGE检测上清和沉淀，剩余部分置于4 ℃备用。

1.2.6 包涵体蛋白纯化 使用50 mL STET缓冲液重悬沉淀，加入DTT至其终浓度1 mmol·L-1。功率200 W、工作3 s、暂停3 s的超声促进杂蛋白溶解，时间10 min。10 000 r·min-14 ℃离心10 min，去上清。重复以上步骤至上清透明。沉淀以1×PBS重悬后经200 W、工作3 s、暂停3 s、时间5 min的超声处理。16 000 r·min-14 ℃离心10 min，去上清。用4 mL 6 mol·L-1盐酸胍重悬包涵体后加DTT至其终浓度5 mmol·L-1。转速220 r·min-1，温度37 ℃的摇床中培养3 h至包涵体全部溶解。10 000 r·min-14 ℃离心10 min，取10 μL上清进行SDS-PAGE电泳检测。

1.2.7 蛋白亲和纯化 0.22 μm过滤器过滤蛋白溶液后。准备Ni-NTA柱，以1 mL·min-1的流速上样蛋白溶液，以6 mol·L-1、pH为8.0盐酸胍缓冲液洗Ni-NTA柱至流出液不含蛋白，即经G250检测后流出液不变色可视为不含蛋白。以含20、60、200 mmol·L-1和500 mmol·L-1咪唑的洗脱液分别进行洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色。以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，并以20%乙醇封柱。在4 ℃下SDS-PAGE电泳检测收集的洗脱液。4 ℃下超滤浓缩产物，SDS-PAGE电泳检测10 μL的浓缩产物。

1.2.8 多克隆抗体制备和鉴定 将纯化的融合蛋白与弗氏完全佐剂按照1∶1体积混合后进行乳化。按500 μg·只-1剂量在2只白兔的皮下多点注射乳化后的融合蛋白。每只兔子免疫3～4次，免疫间隔时间为14 d。检测免疫效价，待抗体表达恒定后采血分离血清，-20 ℃储存。

1.2.9 抗体纯化 以10倍柱床体积、流速为1 mL·min-1的去离子水将ProteinG柱冲洗3～5遍。再以10倍柱体积、流速1 mL·min-1的0.02 mol·L-1PB+0.3 mol·L-1NaCl冲洗3～5遍。取经0.02 mol·L-1PB稀释后的抗血清8 mL，经0.22 μm滤膜过滤后上柱，流速为5～7 s·滴-1。用0.02 mol·L-1PB以2 s·滴-1的流速冲洗至无蛋白流出，检测标准为G250不变蓝。0.1 mol·L-1、pH为3.0的甘氨酸洗脱，并收集洗脱物，经G250检测洗脱产物至不变蓝。饱和碳酸钠调节洗脱产物的pH为中性。使用10 ku超滤管超滤浓缩至1～3 mL。用0.01 mol·L-1和pH为7.4的5 L PBS透析过夜，第2天更换PBS 1次。然后再使用去离子水冲洗层析柱至其为中性，最后使用5倍柱床体积的20%乙醇冲洗层析柱，4 ℃封存。

1.2.10 免疫效价ELISA检测 将2 μg·mL-1的抗原放置在4 ℃中过夜包被。按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000等进行梯度稀释待检血清，各取100 μL加入96孔板作为试验组，空白血清为阴性对照。放置在37 ℃条件下温育1 h后，用200 μL·孔-1的TBST洗涤3遍。10 000倍稀释后羊抗兔-HRP作为二抗，37 ℃温育45 min，用200 μL·孔-1的TBST洗涤3遍，用100 μL·孔-1TMB显色液显色20 min，酶标仪测定OD450值。

1.2.11 Western blotting检测 SDS-PAGE检测分析纯化的融合蛋白、杨树叶片总蛋白、杨树叶片蛋白上清液或沉淀，200 mA湿法转PVDF膜，37 ℃封闭液封闭2 h。加入免疫前兔血清或兔抗血清，37 ℃下摇床孵育1 h。洗涤后，10 000倍稀释后羊抗兔-HRP作为二抗，37 ℃孵育1 h。ECL试剂的A液、B液1∶1混合后滴于PVDF膜正面，暗室反应2 min，显影液反应1 min，定影液定影1 min，晾干，标定Marker后分析PtSVL抗血清的特异性。

2 结果与分析

2.1 PtSVL蛋白的抗原性、亲/疏水性和表面可及性的分析

SVL基因编码蛋白由227个氨基酸组成，预测蛋白分子量为25.6 ku，3×FLAG标签蛋白的分子量为17.0 ku。由图1可看出，丰富且均匀的潜在抗原表位位点分布在SVL蛋白上，抗原指数较高的区段为第1～16、20～37、41～43、50～53、9、88～121、125～132、138～220位和223～227位氨基酸。亲/疏水性预测结果显示PtSVL蛋白平均亲水性为-0.654。亲水性区段主要为第1～17、19～34、52～57、59～84、92～119、124～126、129～130、140～148、150～170位和172～218位氨基酸(图1B)，序列亲水性较强。丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和缬氨酸(Val)疏水性氨基酸分别占编码氨基酸的4.0%、1.3%、4.8%、11.9%、2.6%、2.6%和5.7%。1～16、20～34和59～84等位点具有抗原指数较高、亲水性较强等特征，说明利用SVL蛋白制备抗体的可行性较强。采用Emini方法分析SVL蛋白表面可及性结果如图1C所示，其表面可及性较高的区段为：1～7、9～12、21～28、30～33、68～72、74～80、100～115、127～ 130、141～144、152～157、161～168、175～181、184～198、202～206位和208～218位氨基酸。

综合SVL蛋白亲水性、表面可及性和抗原表位预测结果可知，许多区段在亲水性、表面可及性、抗原表位可能性均较高，比如1～12、21～28、30～33、68～80、100～115 和175～198，使得这些预测区段有更大几率成为抗原表位。

2.2 PtSVL基因的克隆和蛋白结构分析

由图2可见，PCR扩增得到的PtSVL基因大小为684 bp，编码227个氨基酸。多序列比对结果显示，PtSVL蛋白具有MIKC结构，氨基端拥有高度保守的DNA结合MADS结构域，中部有K结构域。MADS和K结构域由一个保守的I结构域连接，而羧基末端C区域可能作为反式活化结构域。

2.3 融合蛋白的表达与纯化

SVL-3×FLAG融合蛋白主要以包涵体形式存在(图3)。重组表达的大肠杆菌经过IPTG诱导后小量表达、超声波裂解后经SDS-PAGE检测、大量表达及破菌检测。在Ni-NTA树脂层析柱中进行纯化。SDS-PAGE检测分析经10倍稀释的纯化融合蛋白，结果见图3，一条清晰的条带显示在42.0 ku处，与预测结果基本一致。

2.4 抗体的纯化结果

取纯化后的PtSVL蛋白分4次免疫2只白兔，进行兔抗杨树PtSVL的多克隆抗体的制备。取免疫后的兔血清，利用Protein G Agarose进行抗体纯化。经4倍稀释后进行SDS-PAGE检测分析。结果见图4，在45.0 ku附近有1条清晰条带，与纯化后的PtSVL融合蛋白显示的大小基本吻合。经Protein G亲和层析柱纯化后的抗体浓度超过10 mg·mL-1，纯度约90%，抗体纯化效果良好。

2.5 SVL融合蛋白血清抗体的免疫效价检测和Western blotting检测

利用间接ELISA法测定PtSVL多克隆抗体效价。将多克隆抗体从1∶2 000开始依次稀释至1∶32 768 000，羊抗兔-HRP稀释10 000倍后作为二抗，加入底物显色终止反应，测定其在450 nm波长处的吸光度。图5结果显示多克隆抗体的效价超过1∶32 000，表明PtSVL融合蛋白可诱导兔产生良好的免疫反应，且抗体效价较高。为了检测PtSVL多克隆抗体的特异性，2只不同兔子纯化的抗体(G1397和G1398)作为一抗，10 000倍稀释后羊抗兔-HRP作为二抗，对融合蛋白进行Western blotting分析。结果显示2 μg·mL-1免疫前兔血清与PtSVL蛋白之间未发生特异性反应，免疫后兔血清纯化的抗体与PtSVL蛋白在42.0 ku处杂交出明显条带(图6A)。提取杨树叶片的总蛋白，免疫前兔血清孵育时未在42.0 ku杂交出明显条带。图6B红框标识显示用纯化的抗体孵育杨树叶片蛋白上清液或者沉淀时，在42.0 ku处杂交出了明显条带。

3 结论与讨论

杨树具有独特的木本结构、多年生、雌雄异株等特性，与拟南芥、水稻等草本植物之间存在巨大的差异[1,7,21]。杨树的维管形成层形成的次生木质部组织产生木质生物量的能力满足社会对木材、纸浆和纸张的需求，具有很高的经济价值[1]。在非生物胁迫中，干旱影响了根系对水分的吸收，导致蒸腾和光合作用减少，严重影响了杨树的生长和发育[22]。MADS-box转录因子的功能分析揭示了它们在植物主要发育过程(如开花、花器官特征)以及与胁迫相关的发育过程(如脱落、果实成熟、衰老)中的作用。OSMADS26基因下调表达的水稻植株对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)和水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)表现出更强的抗性，对干旱也表现出更强的耐受性[23]。

尽管目前已经从各种模式植物中克隆获得了一些MADS基因，并对部分基因的功能和调控网络进行了探究，比如转录因子SVP通过结合CYP707A1/CYP707A3和AtBG1启动子区的CArG位点进而调控这些基因的表达[16]。AGL16能够结合CYP707A3、AAO3和SDD1启动子的CArG并位点调控其转录，导致叶片气孔密度和ABA水平的改变[24]。转录因子除了靶向下游基因的启动子中的特定位点，还可以通过蛋白互作激活或者抑制其他基因。比如，AtMYBL2直接与TT8蛋白结合，抑制DFR和TT8蛋白的表达，进而调控花青素的合成[25]。FD和FT蛋白相互作用在茎尖起作用促进花的转变，并通过花分生组织特征基因AP1(APETALA1)的转录激活来启动花的发育[26]。

为深入揭示杨树MADS转录因子PtSVL在杨树中的生物学功能和其调控网络，本研究构建原核表达载体pET-B2M-PtSVL-3×FLAG，并成功在大肠杆菌表达菌株大量表达。纯化后免疫新西兰公兔，获得了PtSVL多克隆抗体。经间接ELISA法和Western blot 检测后发现抗体的效价高，特异性好。本研究成功制备了PtSVL多克隆抗体，将为解析PtSVL基因功能和探究其上下游通路提供重要基础。