两种禽白血病诊断试剂的比对研究

姜同泉 朱绍辉 齐艳君 行鹏 王小伟 柏程昊 肖发沂

摘 要：本研究同时采用禽白血病ELISA检测试剂盒和禽白血病乳胶微球检测试纸条对已确诊的278份禽白血病临床样品进行检测，比较两种诊断试剂检测结果的差异。经统计分析发现，禽白血病ELISA检测试剂盒敏感性為94.74%，特异性为99.61%，与确诊结果间的Kappa值为0.94;禽白血病乳胶微球检测试纸条敏感性为94.74%，特异性为100%，与确诊结果间的Kappa值为0.97，两种诊断试剂的重复性试验结果均一致。试验结果证明，禽白血病乳胶微球检测试纸条和禽白血病ELISA检测试剂盒都能满足禽白血病的检测需求;由于禽白血病乳胶微球检测试纸条的经济、储存、运输和操作的便捷性，更适用于禽白血病净化。

关键词：禽白血病;ELISA检测试剂盒;试纸条;比对

中图分类号：S858.3 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2022）05-0005-05

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一种免疫抑制性肿瘤病[1-3]，依据病毒囊膜糖蛋白的抗原性差异、病毒干扰试验、宿主范围和基因组的特性，禽白血病病毒已分类至10个亚群，命名为A～J亚群[4]。ALV的自然宿主主要是鸡，以A、B、C、D、E和J亚群为主，感染率高，发病率低，但鸡群感染 ALV 后会造成生产性能下降，给养禽业带来巨大的经济损失，是危害养鸡业的主要疾病之一[5]。

目前，该病还没有切实可行的预防和治疗方法，也没有有效的疫苗，实施种禽ALV净化是控制该病的最根本方法。疫病净化离不开抗原抗体的检测，因此，控制禽白血病的最佳方式是采用准确、快速、适用的检测方法来检测和筛选感染鸡群，从而培育无ALV感染的种鸡群。目前，禽白血病的检测方法较多，临床实践中应用比较多的主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试纸条、PCR等，各种方法有其自身的优点和劣势[6-7]。ELISA法因其具有敏感高、简便快捷、适用于大规模检测的特点备受青睐。近年来，乳胶微球检测试纸条也因其快速、便捷、成本低、较胶体金检测试纸条灵敏度高等优势受到广大诊断研究和研发单位的关注，其灵敏性、特异性和可重复性决定了其最终应用前景。本研究旨在通过3种商品化禽白血病ELISA检测试剂盒与禽白血病乳胶微球检测试纸条在检测ALV方面的灵敏度和特异性[8-9]，比较两种诊断试剂检测结果的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

3种商品化禽白血病ELISA抗原检测试剂盒均为商品化产品，禽白血病乳胶微球检测试纸条为山东畜牧兽医职业学院研制和提供;278份临床样品（包括68份抗凝血样品、210份血清样品）均为临床采集的病料。

1.2 方法

1.2.1 临床样品的确诊 采用GB/T 26436-2010禽白血病诊断技术中规定的荧光定量PCR方法操作规程对278份临床样品进行检测和判定结果。

1.2.2 两种诊断试剂敏感性和特异性比对 将1.2.1中确诊的278份临床样品同时采用禽白血病乳胶微球检测试纸条和禽白血病ELISA检测试剂盒进行检测、比对。均按照各自的说明书操作和判定结果，并按公式：敏感性 Se=a/（a+c），特异性Sp=d/（b+d）[9-11]，假阳性率=b/（b+d），假阴性率=c/（a+c），计算两种检测试剂的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率（表1）。按照公式 Kappa=2（ad-bc）/（p1q2+p2q1），计算两种试剂与SAT结果间的Kappa值，比较其符合程度。Kappa值为0.81～1.00时，判定两种方法完全符合;为0.61～0.80时，判定两种方法高度符合;为0.41～0.60时，判定两种方法中度符合;为0.21～0.40时，判定两种方法比较符合;0.20以下为轻度符合;0以下为不符合[12]。

1.2.3 两种诊断试剂重复性比对 随机选取经荧光定量PCR方法确诊的禽白血病样品（编号P1～P10）和阴性样品（编号N1～N10）各10份，采用禽白血病乳胶微球检测试纸条和禽白血病ELISA检测试剂盒同时进行重复性试验，比对两者的稳定性。

2 结果

2.1 临床样品的确诊结果

采用GB/T 26436-2010禽白血病诊断技术中规定的荧光定量PCR方法操作规程对278份临床样品进行检测和判定结果。结果确诊19份禽白血病阳性样品（包括10份抗凝血样品，9份血清样品）和259份禽白血病阴性样品（包括59份抗凝血样品和200份血清样品）。

2.2 敏感性、特异性比对

采用禽白血病乳胶微球检测试纸条检测2.1中已确诊的278份临床样品，共检出18份阳性样品、259份阴性样品，敏感性为94.74%（18/19），特异性为100%（259/259），假阳性率为0（0/19），假阴性率为5.26%（1/19），与荧光PCR方法的Kappa值为0.97;采用禽白血病ELISA检测试剂盒检测2.1中已确诊的278份临床样品，共检出18份阳性样品、258份阴性样品，敏感性为94.74%（18/19），特异性为99.61%（258/259），假阳性率为0.39%（1/259），假阴性率为5.26%（1/19），与荧光PCR方法的Kappa值为0.94，如表2所示。

2.3 重复性比对

随机选取确诊的禽白血病样品（编号P1～P3）和阴性样品（编号N1～N3）各5次，采用禽白血病乳胶微球检测试纸条和禽白血病ELISA检测试剂盒同时进行重复性试验，比对两者的稳定性。结果显示，两种诊断试剂的检测结果均一致，即两种诊断试剂的重复性良好，如表3所示。

3 讨论

ALV不同亚群能够诱发不同种类的白血病，是鸡肿瘤性疾病最主要的病原体[13]，也是目前已知的唯一拥有外源性和内源性重复活性的逆转录病毒[14]，是最先被人们关注并研究的禽的三大肿瘤性疾病之一。鸡感染ALV后的诊断可以根据流行病学及器官和组织的典型病理学变化进行初步判定，实验室病原的检测作为确诊依据。实验室诊断主要包括病毒的分离鉴定、间接免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、核酸检测、胶体金试纸条等[15]。1FAB15F2-9EBA-480A-9E5E-ABB40618407E

ALV分离鉴定可采用的样品丰富，包括全血、血清、血浆、泄殖腔拭子及组织器官等，方法可靠，特异性高，能够排除内源性ALV的干扰，是国际公认的金标准，但病毒分离后需要接种于细胞上进行培养鉴定，操作較繁琐，技术性较高，全过程耗时较长，大约需要10 d时间，不适用于大规模的快速检测[16]。间接免疫荧光也具有较高的灵敏度和特异性，然而对于间接免疫荧光的结果判定存在一定的主观性，如一些非特异性或者微量荧光的判定结果常常因人而异[15]。酶联免疫吸附试验（ELISA）和核酸检测目前在临床中应用较多，具有较强的特异性和灵敏度，但是易出现内源性ALV假阳性，并且对设备要求高，需要与检测相适应的操作环境和人员，在基层诊断中使用难度较大。禽白血病基层的临床诊断需要一种特异性强、敏感度高、在操作上简便快捷以及对人员、设备、环境等要求低、更适用基层诊断的方法，而免疫层析试纸条具备便捷、快速、成本低的特点，且随着技术的进步，特异性和敏感性不断提高，在动物疫病检测中应用广泛[17-18]，日益受到基层诊断工作者的接受。

目前，市面上只有胶体金检测试纸条，但胶体金检测试纸条存在灵敏度偏低、稳定性较差的缺点，而乳胶微球检测试纸条由于采用的标记载体是乳胶微球，这就克服了胶体金烧制过程中容易出现的颗粒不均匀、产品质量不稳定、均一性差的问题，并且微球亲水表面且基团含量丰富，使得蛋白结合能力更高、灵敏度更高，是胶体金的理想替代品。从本研究结果也可以看出，禽白血病乳胶微球检测试纸条与禽白血病ELISA抗原检测试剂盒敏感性、特异性和重复性均较好，均可以用于养禽场禽白血病的净化，但乳胶微球检测试纸条因其使用便捷、快速、成本低廉，因而更适于基层养殖场应用。

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