生物炭和菌根对降低玉米吸收重金属镉的联合效应

张华纬

（长治学院 生命科学系，山西 长治 046011）

当前，我国在农业领域存在土壤重金属污染问题。其中，由于镉（Cd）的生物有效性高，与其他重金属元素相比更易在农产品中积累，因而在农产品中Cd 超标排在首位[1]。Cd 可在土壤-植物系统中迁移，通过食物链危害农产品安全和人体健康。近年来，关于植物吸收富集污土中重金属的研究备受关注。很多研究表明，生物炭总体上钝化重金属的效果显著，如利用鸡粪生物炭对Cd 和Pb 固化效率可达到88.4%和93.5%[2]。生物炭的钝化效果还与生物炭种类、用量和热解温度等有关[3,4]。

近年来研究者发现，采用生物吸附措施也能有效抑制重金属的生物有效性。其中，丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，以下简称AMF）可以通过螯合作用或者过滤作用直接降低植物吸收重金属[5]；可改善植物生长状况，提高植物吸收营养元素效率，减轻重金属对植物的毒害；真菌还能向土壤中分泌一种可与土壤重金属络合的糖蛋白-球囊霉素以络合重金属离子[6]。然而，污染土壤中AMF 对宿主植物生长及吸收重金属的影响存在差异[7]，可能与不同AMF 种类在侵染率、菌丝生长、植物营养元素运输效率等方面存在差异有关，直接影响到菌根共生体的生理特性，影响菌根效应[8]；也可能与土壤理化环境有关，如在缺磷区可提高对磷素的吸收，从而激发AMF 的活性[9]。

生物炭或者AMF 的单一作用已被多位研究者证实。而有学者研究发现，施用生物炭能通过改变土壤资源储备（如可利用 C、营养物质、水分等）、非生命成分（如 pH、CEC 等）等理化性质，加快土壤细菌和真菌的生长与繁殖[10]，改善AMF的活性和侵染率，使AMF 分泌更多的球囊霉素以络合土壤重金属离子，从而降低重金属有效性。如Ezawa 等[11]发现，稻壳生物炭增加了土著真菌（Glomus spp.）的生物量以及对万寿菊的侵染率；Liao 等[12]发现棉花秸秆生物炭促进了土壤中细菌、真菌和放线菌的群落丰富度；Zakariam 等[13]研究表明添加桉木生物炭0.6-6 t 两年后，小麦根部AMF提高了20-40 %，而未添加生物炭仅提高5-20%；Rilling 等[14]发现生物炭能促进真菌共生，从而有效促进AM 孢子萌发。

故笔者猜想将两者联合作用于重金属污染土壤中，可能优于单一的作用效果。两者的交互效应仍未研究并证实。因此，文章通过将生物炭和AMF 同时作用于亏磷条件下原位Cd 污染土中，探究生物炭和菌根的协同作用对玉米生长和吸收富集土壤重金属镉的影响，并探究其作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

供试植物为玉米（Zea mays L.），品种为郑丹958，挑选出颗粒饱满、大小一致的种子。在播种前对玉米种子进行催芽，具体催芽方法为：用去离子水冲洗三遍，在10 %的双氧水（H2O2）中浸泡30 min 后冲洗干净。将种子置于润湿培养皿中，置于25 ℃的培养箱中培养，1-2 d 待玉米种子露白后播种。播种时玉米种子每盆播种2 粒，在玉米三叶期时间苗，拔除1 颗长势不齐者，留长势一致的幼苗一株。

1.1.2 土壤及生物炭

供试土壤采自湖南省衡阳市大浦镇炉铺村（112 °47 ″29.38 ′E，27 °00″ 20.77 ′N），为矿区附近弃耕多年的原位Cd 污染黄棕壤，采集区域内分上、中、下三个小区，每个小区选择三个5 m×5 m 的样方，样方中按对角线随机取土，取土深度为 0-20 cm。取回风干后过2 mm 筛备用。

水稻秸秆采集自江西省丰城市，400 ℃热解后、研磨过100 目筛制得生物炭。土壤及生物炭理化性质见表1、表2。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Basic properties of the studied soil

表2 供试水稻生物炭基本理化性质Table 2 Basic properties of the rice straw biochar

1.1.3 AMF

Funneliformis mosseae（原菌种名为Glomus mosseae，简称为G.m）引自北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种植资源库（BGC）”。此菌剂是经高粱扩繁后得到的含有菌根真菌孢子、宿主植物根段和根外菌丝的砂石混合物。经测定，此菌剂的孢子密度为70 个/10 g 孢子。

1.2 试验设计

试验采取两因素完全随机试验设计。因素一为生物炭，分为接种生物炭和不接种生物炭；因素二为AMF，分为接种AMF 和不接种AMF。共4 个处理，每个处理重复4 次：对照（CK）、单一添加生物炭处理（BC）、单一添加AMF 处理（AM）、同时添加生物炭和AMF 处理（BA）。

试验采用规格为9×10×11 cm 的塑料盆钵作为培养容器（盆钵底部放托盘防止重金属离子流失），每盆中加入500 g 过2 mm 筛且经λ 射线灭菌的土壤，每盆分别按照每千克土壤0.3 g N、0.3 g K 施入尿素和硫酸钾。施入生物炭的处理按照3.0 %的比例与土壤均匀混合后装盆，未施入生物炭的处理直接装盆。加入以上材料混合稳定10 d 之后接种AMF 的处理每盆加入15 g 菌剂，不接种AMF的处理每盆加入15 g高温灭菌菌剂，采用局部接种方式，加入到距离表层2 cm 处，同时每盆加入10 mL 土壤滤液，以恢复辐射灭菌前的土壤微生物区系。将催芽后的玉米种子播种。

试验在智能温室中进行，生长温度为25℃±2，相对湿度50 %，平均日照时间为13 h。试验期间根据玉米的生长习性适时适量浇去离子水，根据实际情况进行人工除草除虫，49 d后收样。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 植物相关指标

植物生物量：样品于105 ℃杀青30 min、75℃烘干48 h 至恒质量，测定生物量。

植物体内重金属的消解和测定：硝酸微波消解，ICP-MS 法测定。取过10 目植物样品0.25 g于微波消解管中，加入8.00 mL 硝酸（优级纯），加盖密封放入通风橱中过夜；第二天将消解管对称放入微波消解仪器腔体中，选择180 ℃、30 min 消解程序，开始消解；待温度下降到80 ℃以下时取出消解管，放入160 ℃用于赶酸的电热板中加热赶酸50 min；再用超纯水将消解液完全转移到50 mL 容量瓶中并定容，摇匀；再过滤到15 mL 离心管中，过滤液用于ICP-MS 测定重金属浓度。

1.3.2 土壤相关指标

土壤DTPA 有效态Cd 的测定：CaCl2-DTPA-TEA 溶液浸提-原子吸收光谱法。取过2 mm 筛的待测土样5.00 g，加入 DTPA 浸提剂（二乙三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺缓冲浸提剂）25.0 mL，在 20-25 ℃、180 r·min-1振荡2 h，过滤，过滤液采用原子吸收分光光度计（zenith 700p，德国耶拿）测定过滤液中Cd 浓度。

土壤 pH 采用 pHS-3C 型pH 计测定。

土壤可溶性有机碳（DOC）测定：硫酸钾浸提-分光光度计比色法[15,16]。称取过2 mm 筛的土壤5.00 g 于50 mL 离心管中，加入0.5 mol/L 的硫酸钾浸提剂20 mL，25 ℃下震荡30 min，用0.45 μm 滤膜抽滤；取得滤液后，取1.00 mL 滤液，用去离子水稀释到5 mL，然后加2.5 mL，10 mmol/L 的Mn-Ⅲ-焦磷酸和2.5 mL 浓硫酸，摇匀，静置1 小时后，用紫外分光光度计，在490 或500 nm 波长下比色。

土壤球囊霉素相关蛋白（GRSP）的测定：考马斯亮蓝比色测定[17]易提取球囊霉素相关土壤蛋白（EE-GRSP）：称取0.75 g 土样，加入6 mL，20 mmol/L 柠檬酸缓冲液（pH=7.0），121℃灭菌1 h，然后10000 r/min 离心20 min；难提取球囊霉素相关土壤蛋白（DE-GRSP）：在提取EE-GRSP 后的残渣中，加入6 mL、50 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH=8.0），121 ℃灭菌1 h，然后10000 r/min 离心10 min。再采用考马斯亮蓝试剂盒（A045-2）进行测定。EE-GRSP+ DE-GRSP即为土壤中总球囊霉素。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2010 办公软件和SPSS19.0 进行统计分析和作图。用单因素方差分析（ANOVA）比较不同处理间的差异，置信度95 %水平下，最小显著差数法（LSD）比较各处理间的差异显著程度；用双因素方差分析比较生物炭、AMF 单一以及联合的交互作用；用双变量相关分析法分析植物体内重金属含量与土壤DTPA 有效态重金属含量及其它土壤相关因素之间的相关关系。

2 结果与分析

2.1 施加生物炭和AMF 对玉米生长的影响

2.1.1 株高

由图1 可知，施加生物炭比不施加生物炭的处理极显著增加了玉米株高。到第49 d 时，添加生物炭的处理平均株高达到119.68 cm，而不加生物炭株高只有69.06 cm，增加幅度为73.3%。而AM 处理和CK 对照、BA 处理和BC 处理差异不显著。

图1 施加生物炭和AMF 对玉米株高的影响Fig.1 The effect of biochar and AM on the height of corn (cm)

双因素方差分析表明，生物炭的单一作用对玉米株高的促进效果极显著（P=0.000***），AMF 的单一作用以及两者的交互作用对玉米株高的促进效果不显著（P＞0.05，NS）。

2.1.2 生物量

单因素方差分析表明（表3），AM 处理组与CK 对照组之间无显著差异，说明添加AMF对玉米生物量无显著影响；BC 处理组生物量显著高于CK 对照组，说明添加生物炭显著增大了玉米生物量；除地上部生物量BC 处理组和BA处理组差异显著外，地下部、总生物量BC 处理组和BA 处理组差异不显著。说明总体上同时施加AMF 和生物炭的处理并没有优于只施加生物炭的单一处理。

表3 施加生物炭和AMF 对玉米生物量的影响Table 3 The effect of biochar and AM on biomass of corn

双因素方差分析表明，生物炭表现出了极显著的效应（P=0.000***），AMF 的单一效果以及生物炭和AMF 的交互效应都不显著（P＞0.05，NS）。

2.2 施加生物炭和AMF 对玉米镉浓度的影响

单因素方差分析表明（表4），地上部Cd 含量AM 处理组和CK 无显著差异，而BC 处理组Cd 浓度显著低于CK 对照组，说明添加AMF 对玉米体内重金属浓度无显著影响，生物炭极显著降低玉米体内重金属含量；BA 与BC 组无明显差异，说明同时添加两者的处理并没有优于只添加生物炭的单一处理。

表4 施加生物炭和AMF 对玉米镉浓度的影响Table 4 The effect of biochar and AM on Cd of corn

双因素方差分析表明，生物炭单一作用使得植物地上地下部重金属含量极显著降低（P=0.000***），AMF 单一作用对植物Cd 含量无显著影响（P＞0.05，NS）。生物炭和AMF 交互效应虽显著影响了地下部镉浓度，但交互效应并没有优于生物炭的单一作用（P＞0.05，NS）。

2.3 施加生物炭和AMF 对土壤DTPA-Cd 浓度的影响

BC 处理显著降低了土壤DTPA-Cd 浓度，而CK 与AM 处理组之间没有显著性，BC、BA 处理组之间也没有显著性。双因素方差分析表明（表5），生物炭单一效应极显著（P=0.000***），说明生物炭显著降低了土壤有效态Cd 浓度，降低了生物有效性；而AMF 的单一作用效果以及生物炭和AMF 的交互效应不显著（P＞0.05，NS），说明AMF 的添加并没有降低土壤重金属的有效性，生物炭、AMF 的联合作用也没有优于生物炭的单一作用。

2.4 生物炭和AMF 对pH、DOC、GRSP 的影响

2.4.1 对土壤pH 的影响

单因素方差分析表明（表5），土壤pH 从小到大的排序组别为：AM＜CK＜BC＜BA。也就是说，添加生物炭处理的pH 显著大于未添加的处理。双因素方差分析表明，生物炭极显著升高pH（P=0.000***），AMF 单一作用以及生物炭*AMF 交互作用不显著（P＞0.05，NS）。

表5 施加生物炭和AMF 对土壤Cd 有效性及相关指标的影响Table 5 The effect of biochar and AM on DTPA-Cd and values

2.4.2 对土壤DOC 的影响

在土壤中，可溶性有机碳（DOC）作为重金属的有机配体，对土壤溶液中的微量重金属的可移动性和迁移过程以及金属复合物的形成过程有着重要作用。它们通过与水体、土壤和沉积物中的金属离子、氧化物、矿物和有机物之间的离子交换、吸附、络合、螯合、絮凝、氧化还原等一系列反应,改变重金属的生物毒性、迁移转化规律与最终归宿[18]。

单因素方差分析表明，添加生物炭处理的DOC 大多数大于未添加的处理，AMF 对不同处理影响不同。双因素方差分析表明，生物炭极显著得导致了DOC 升高（P=0.001**），AMF 的单一作用以及生物炭*AM 真菌交互作用不显著（P＞0.05，NS）。

2.4.3 对土壤球囊霉素的影响

球囊霉素作为AMF分泌的一种土壤糖蛋白，可与土壤重金属离子形成络合反应，降低重金属的迁移作用。

单因素方差分析表明，土壤GRSP 不同处理之间均无显著差异。双因素方差分析表明，AMF的单一作用，以及生物炭*AMF 交互作用均不显著（P＞0.05，NS）。说明在整个实验中，AMF几乎未分泌球囊霉素以发挥其降低Cd 生物有效性的作用。

2.4 生物炭和菌根的协同作用对植物吸收富集镉的影响因素分析

本试验设计在原位镉污染土壤条件下施用生物炭和AMF，拟探究两者对植物吸收Cd 的影响。生物炭或者AMF 导致Cd 有效性发生变化的可能因素都会影响土壤Cd 有效态浓度变化，从而影响植物对重金属的吸收富集。为了探究两者影响Cd 的相关因素，研究了土壤pH、DOC、GRSP浓度与土壤Cd 有效态的相关关系，再探讨土壤镉含量与植物地上部Cd 浓度的相关关系。

土壤不同理化性质可能影响土壤中镉的生物有效性含量。相关分析表明（表6），与土壤DTPA-Cd 呈极显著负相关关系的因素为土壤DOC、pH（P＜0.01**），说明生物炭可通过提高土壤pH 及土壤DOC 含量来降低镉的生物有效性。GRSP 与DTPA-Cd 相关分析没有显著性，可能是由于Cd 污染程度很高，影响了AMF 繁殖，降低了其分泌球囊霉素的能力以络合土壤重金属离子。土壤DTPA-Cd 与植物地上部Cd 浓度呈极显著正相关关系（P＜0.01**），说明土壤有效态浓度会影响植物对土壤重金属的吸收富集。

表6 影响Cd 有效性可能因素的相关分析Table 6 The correlation of the factors that influence the Cd

3 讨论

通过在原位重金属镉污染土壤上施用生物炭或接种AMF 来研究两者对植物吸收富集重金属镉的联合效应，并探讨影响重金属生物有效性的机理。

3.1 生物炭降低重金属生物有效性效应

本试验中生物炭的作用效果得到了明显证实。生物炭显著促进了玉米株高的生长、提高了玉米地上地下部生物量，显著地降低了植株地上地下部Cd 含量。生物炭对植物生长的促进作用以及降低植物体内含量的作用在很多研究中被充分证实，如刘阿梅等[19]发现生物炭可明显增加圆萝卜和小青菜可食部分生物量，Cd 含量分别减少了81.21 %和83.04 %，并且达到食用标准；Qiao YH 等[20]发现生物炭有利于玉米植株生物量以及株高的增加；侯艳伟等[21]报道生物炭可降低油菜可食部分Cd、Pb 的含量，并达到国家标准。本研究发现生物炭对土壤pH 升高效应极显著。本试验中土壤pH 为4.3，为偏酸性，添加pH 为10.51 的生物炭有利于土壤pH 的升高，生物炭对酸性土壤pH 的改良效应在很多研究中都有充分体现[22-25]。土壤pH 升高，会结合土壤水体中易迁移的重金属离子，影响重金属在土壤中的迁移性，降低土壤中有效态 Cd 含量，有研究发现生物炭可在很短的时间内提高土壤pH[26]，也在本基础研究试验中得到充分证实。

生物炭可以增加土壤有机碳含量，促进土壤团聚体的形成，使得土壤重金属离子与有机质发生反应，降低其生物有效性[18]。由于生物炭中C储备较大，施入土壤中将小分子有机质释放到土壤溶液中，使其升高。生物炭对土壤可溶性有机碳的作用在不同研究中不同。章明奎等[27]发现生物质炭可显著提高土壤有机碳的积累，但降低了土壤水溶性有机碳，而其下降可能与生物质炭对其吸附固定有关；马莉等[28]发现了施用生物炭量为5 g/kg、10 g/kg 时土壤水溶性有机碳含量显著高于对照。本试验发现影响土壤DOC 的交互作用是复杂的，因为DOC 在土壤中含量不稳定，有时会与土壤颗粒结合吸附和释放导致土壤溶液中DOC 含量的下降或上升，有时也可能被微生物分解利用而导致变化，且土壤含水量、pH 值也会影响水溶性有机碳的吸附平衡[29]。

3.2 AMF 降低重金属生物有效性效应

本试验中，AMF 对重金属生物有效性和植物体内重金属浓度无显著单一作用。AMF 因无活性以及没有侵染植物根系，使得其并没有分泌多余的球囊霉素来络合土壤中重金属以降低有效态重金属浓度，从而减少植物吸收重金属，所以其总体效应不显著。可能是由于Cd 污染程度很高，影响了AMF 繁殖。如张旭红等[30]研究在0、100、200 mg/kg 的Cu 污染条件下AMF 对旱稻生长的影响发现，Cu 污染水平越高，AMF 侵染能力越差，200 mg/kg 条件下的侵染率与CK 相比下降了100 %以上；或是土壤的酸性条件不利于G.m 真菌的孢子萌发，Hayman 等[31]研究发现，G.m 不适合酸性土壤，在中性或微碱性条件下孢子萌发最好。在pH 为6-7 时促进了植物的生长。本试验土壤Cd 浓度严重超标且pH 较低，可能影响了AMF 发挥作用，故未分泌球囊霉素。由于AMF 未发挥其单一作用，所以AMF 和生物炭的联合作用与生物炭单一作用相比并没有促进植物生长，并且降低了重金属的生物有效性。

4 结论

生物炭可显著降低污染土壤中DTPA-Cd 有效态含量，降低镉的生物有效性，从而显著降低了玉米地上地下部Cd 浓度，生物炭也能明显改善植物的生长状况以削弱重金属对其的毒害作用。生物炭主要作用是通过显著增大土壤pH、DOC 来削弱 DTPA-Cd 有效态浓度。

而AMF 的单一作用以及生物炭*AMF 的联合作用不显著。AMF 由于土壤酸性过强或土壤Cd 污染严重超标导致其很少侵染玉米植物根系，甚至很少存活繁殖，并未通过分泌球囊霉素来发挥其降低Cd 生物有效性的作用。在本试验中，由于AMF 未发挥作用，生物炭和AMF 对于降低植物吸收重金属的联合效应未体现。生物炭和菌根的联合效应仍需继续研究。