葛根素对棕榈酸诱导胰岛MIN6细胞损伤的保护作用

陈 铭，莫广艳，叶 溪，徐小惠，高雨桐，张晓琳，吴娅妮，韦秀莎，黄仁彬，梁 韬

(1.广西医科大学药学院，2.广西壮族自治区人民医院，3.广西医科大学附属肿瘤医院，4.广西医科大学附属口腔医院，5.广西壮族自治区卫生健康委员会口腔感染性疾病防治重点实验室，广西 南宁 530021)

随着人类生活水平的不断提高，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)已经成为严重影响人类健康生活质量的公共卫生问题，而且T2DM的发病呈现逐年年轻化[1]。T2DM是一种病因复杂的慢性全身性疾病，以胰岛素抵抗、血液中葡萄糖水平升高和胰岛β细胞功能障碍为主要特征[2]。其中，肥胖是导致T2DM的主要影响因素之一，高水平的游离脂肪酸对胰岛β细胞可产生明显毒性作用，并可诱导机体发生胰岛素抵抗。研究表明，长期暴露于高浓度的游离脂肪酸则可导致胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病[3-4]。因此，探讨抑制游离脂肪酸诱导的胰岛功能损伤和胰岛β细胞凋亡的策略，对T2DM的防治具有非常重要的意义。

葛根素(puerarin，PR)是从豆科植物野葛PuerarinLobata(Wild) Ohwi根部中提取的异黄酮类生物活性成分。在我国已被广泛应用于T2DM、糖尿病肾病、糖尿病心肌病等糖尿病并发症的治疗[5]。前期研究发现，葛根素可明显改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠糖尿病前期状态，改善胰腺超微组织损伤[6]。但目前尚未有相关文献明确葛根素对胰岛细胞的体外保护作用机制，因此，本研究将采用体外培养的小鼠胰岛β细胞株(MIN6细胞)，观察葛根素对棕榈酸诱导的MIN6细胞损伤和凋亡的影响，并从NF-κB信号通路及凋亡相关因子的角度探究其可能机制。

1 材料

1.1 实验细胞MIN6细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司,货号：CL-0674 。

1.2 药品与试剂葛根素注射液(山东方明药业集团股份有限公司，批号：H20033292)、棕榈酸钠(鲲创科技股份有限公司，批号：KCSJ002)、胎牛血清(Gemini公司，批号：A58G00J)、RPMI 1640培养基(美国Giboco公司，批号：8119267)、0.25%含EDTA胰酶(北京索莱宝公司，批号：20201217)、青霉素/链霉素(北京索莱宝公司，批号：20201101)、β-巯基乙醇(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：WH01112009XP)、LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200613)、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200411)、GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200510)、GAPDH多克隆抗体(中国Proteintech公司，批号：10494-1-AP)、NF-κB抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：CN89330)、p-NF-κB抗体(美国Cell Signaling Technology 公司，批号：16)、Bax抗体(中国Proteintech公司，批号：50599-2-lg)、Bcl-2抗体(中国Proteintech公司，批号：26593-1-AP)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(Invitrogen中国公司，批号：VC303853)

1.3 主要仪器二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司，型号：31111)、超净工作台(苏州净化设备总厂，型号：1450型)、小型高速冷冻离心机(德国ThermoIEC公司，型号：Micro CL17R)、荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会，型号：奥林巴斯CKX-41)、连续光谱扫描式酶标仪(香港分子仪器公司，型号：SpectraMaxPlus384)、垂直电泳仪(美国Bio-Rad中国有限公司)、双色红外荧光成像系统(美国Li-COR OdysseClx公司)。

1.4 MIN6细胞的培养将MIN6细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中(含1%青霉素-链霉素、50 μmol·L-1β-巯基乙醇)，置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养，2～3 d换液1次，待细胞生长至接近融合时，用0.25%胰酶消化、传代培养，继续后续实验。

1.5 MTT法检测MIN6细胞的存活率将MIN6细胞制备成单细胞悬液，计数，以5×103/孔的密度接种于96孔板中。待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为正常组( Normal control )，模型组(Model control )，葛根素高、中、低剂量组(PR 5、2.5、1.25 mg·L-1)，分别加入相应浓度的含药培养基或完全培养基预处理2 h后，除正常组外，其余各组加入120 μmol·L-1的棕榈酸，共同培养24 h。每孔加入10 μL MTT试剂和90 μL无血清培养基，培养箱培养4 h后，酶标仪490 nm处检测各孔吸光度值(A值)，计算细胞存活率。

1.6 细胞LDH、MDA和GSH的测定细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组细胞处理结束后，收集细胞上培养清液，根据LDH含量检测试剂盒说明书，检测并计算细胞上清中LDH含量。采用超声破碎法破碎细胞，细胞破碎完毕后离心取上清，根据MDA含量检测试剂盒和GSH检测试剂盒说明书进行检测和计算。

1.7 细胞AOEB染色及形态观察将对数生长期的细胞按每孔5×104/孔的密度接种于6孔板中，细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组给药处理结束后，弃除完全培养基或含药培养基，用PBS轻柔清洗1遍细胞，每孔再加入500 μL的PBS，然后将配置好的AOEB工作液(将AO和EB两种溶液按照1 ∶1混合配置)，5 μL/孔加入各组细胞中，室温避光染色5 min，染色结束后，弃去荧光染液，用PBS清洗1遍细胞，采用倒置荧光显微镜观察细胞凋亡情况并拍照记录。

1.8 Western blot法检测各组细胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表达情况细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组细胞处理结束后，用PBS冲洗1～2次，各组加入含PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，12 000g离心15 min，取上清即为各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，根据目的蛋白分子量的大小采用不同浓度的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，TBST溶液洗膜3次后，4 ℃冰箱孵育按1 ∶500或1 ∶1 000稀释的一抗过夜，TBST重新洗膜3次，每次5 min室温摇床孵育加HRP标记的山羊兔二抗0.5～1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，双色红外荧光成像系统曝光扫膜，以GAPDH作为内参蛋白校正，实验结果用ImageJ分析软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 葛根素对MIN6细胞存活率的影响120 μmol·L-1棕榈酸孵育MIN6细胞24 h后可以诱导MIN6细胞损伤(P<0.01)；与模型组相比，不同浓度葛根素预处理2 h后，120 μmol·L-1棕榈酸共同孵育24 h可减轻棕榈酸诱导的细胞损伤(P<0.01或P<0.05)。提示葛根素可有效改善棕榈酸诱导的细胞损伤(Tab 1)。

Tab 1 Effects of PR on viability of palmitic

2.2 各组细胞上清液LDH含量的比较结果显示，模型组LDH释放量，MDA含量明显增加，GSH活性明显下降(P<0.01或P<0.05)，说明此时棕榈酸对MIN6细胞造成了损伤。当加入不同浓度葛根素预处理2 h后,120 μmol·L-1棕榈酸共同孵育24 h时，随着葛根素浓度的增加，MIN6细胞中LDH释放量呈现明显(P<0.01或P<0.05)剂量依赖性下降趋势，葛根素高、中剂量组MDA含量明显降低，GSH活性明显增加(P<0.01或P<0.05)。结果表明，葛根素能够减轻棕榈酸造成的细胞损伤(Tab 2)。

Tab 2 Effects of PR on level of LDH，MDA and GSH in palmitic acid-induced MIN6 cells

2.3 细胞AOEB染色及形态观察如Fig 1所示，正常组细胞生长良好，贴壁情况良好，呈现亮绿色荧光，模型组细胞出现凋亡，发出橘红色荧光，对于葛根素给药组，高剂量组的呈现黄绿色荧光，中剂量开始出现早期凋亡细胞，呈现橘黄色荧光，低剂量组坏死细胞最多，呈现橘红色荧光。结果提示，葛根素可以改善棕榈酸引起的MIN6细胞凋亡。

Fig 1 Effects of PR on apoptosis of palmitic acid-induced MIN6 cells (200×)A: Normal control; B: Model group; C: PR 5 mg ·L-1; D: PR 2.5 mg·L-1；E: PR 1.25 mg·L-1

2.4 葛根素对MIN6细胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表达的影响各组细胞中目的蛋白表达结果如Fig 2所示。与正常组相比，模型组中NF-κB p-p65、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调(P<0.01)；与模型组相比，葛根素高、中剂量组NF-κB p-p65、Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调(P<0.01或0.05)。提示葛根素能减少炎症因子NF-κB p-p65蛋白和促凋亡因子Bax蛋白的表达，同时促进抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达。

Fig 2 Effects of PR on Bax，Bcl-2，p65 and p-p65 expression of palmitic acid-induced MIN6 cells

3 讨论

T2DM的发病因素众多，近年来，脂毒性在T2DM的发生发展中的作用受到广泛关注。研究表明，长期暴露于高水平的游离FFA中，一方面会减少葡萄糖刺激的胰岛素分泌，引起胰岛素抵抗;另一方面可诱导胰岛β细胞发生凋亡，激活炎症因子，导致胰岛细胞损伤[7-8]。因此，抑制脂毒性诱导的胰岛细胞损伤有望成为治疗T2DM的有效途径之一。本研究采用棕榈酸作为造模刺激物，从细胞水平来探讨葛根素对脂毒性诱导的胰岛β细胞的作用。实验结果表明，MTT法、LDH、MDA和GSH试剂盒均提示葛根素具有改善棕榈酸引起的MIN6细胞损伤的作用，AOEB荧光染色法结果提示葛根素具有抑制MIN6细胞凋亡的作用。

NF-κB是重要的核转录因子之一，在细胞炎症、损伤中具有重要的调节作用[9]。当刺激因素激活后，NF-κB核转移过程增强，其与相应的靶基因结合，参与调控一系列炎症因子等促炎基因的表达，最终导致细胞功能受损甚至凋亡的发生。大量研究显示[10-12]，NF-κB信号通路的激活与糖尿病发生的胰岛β细胞凋亡及损伤密切相关，抑制NF-κB信号通路的活化可以有效保护胰岛β细胞。Western blot结果表明，与正常组相比，模型组NF-κB p-p65表达明显上调，说明造模成功。与模型组相比，葛根素高剂量组NF-κB p-p65表达明显下调，提示葛根素有较好的抑制NF-κB通路活性，改善MIN6细胞损伤的作用。

β细胞凋亡在T2DM的发生发展过程中起到重要的作用，T2DM患者的胰岛β细胞数量明显减少[13-14]。Bcl-2家族的凋亡相关基因Bcl-2、Bax是调控胰岛β细胞凋亡的重要因子。其中，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因蛋白，为线粒体膜的整合蛋白，可通过线粒体途径、内质网途径抵抗细胞凋亡；Bax是促进细胞凋亡的基因蛋白，当接收到凋亡信号刺激被激活后，分子构象发生改变，形成Bax/Bax二聚体，进而促进细胞凋亡[15-16]。Western blot结果显示，与正常组相比，模型组Bax表达明显上调，Bcl-2表达明显下调，说明造模成功。与模型组相比，葛根素高、中剂量组Bax表达明显下调，Bcl-2表达明显上调，提示葛根素有明显的抑制棕榈酸引起的MIN6细胞凋亡的作用。

综上所述，葛根素可改善棕榈酸诱导的胰岛MIN6细胞的氧化应激状态，进而抑制凋亡和炎症反应而改善胰岛细胞的功能。因此，葛根素对胰岛MIN6细胞的保护机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达及抑制NF-κB信号通路有关。