不同季节银杏叶提取物对奶牛乳房炎病原菌体外抑菌试验

张国礼，马高民，柏文芳

（1.南京卫岗奶业集团奶源公司，南京 210095；2.南京市江宁区汤山街道动物疫病防治站，南京 211131）

奶牛乳房炎是奶牛养殖业常见的疾病，其发病率高，约为40%～70%，且危害严重。奶牛乳房炎的高发、频发给奶牛养殖业带来了重大的经济损失，制约着奶牛养殖业的发展，我国每年由奶牛乳房炎造成的经济损失约在150亿～450亿人民币之间[1]。导致奶牛乳房炎发生的因素很多，病原微生物感染是其主要病因，其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌是引起乳房炎发生的主要致病菌。目前，奶牛乳房炎的治疗仍然以抗生素治疗为首选方法，但随着乳房炎细菌耐药性的不断增强，乳房炎的治疗变得更加困难。中药是纯天然药物，含有多种生物有效成分，具有低毒、无残留或低残留、抗菌、消炎和不易产生耐药性的特点，因此，国内外专家逐渐关注应用中药来治疗奶牛乳房炎[2]。银杏又称白果，属我国的特产资源。有研究表明，银杏叶及其提取物含有黄酮类、内酯类、酚类、萜类、多糖等多种活性物质，具有抗氧化、抑菌、提高免疫力、抗炎、抗病毒等多种生物活性[3]，在防治奶牛乳房炎上具有广阔的应用前景。本试验选取三个奶牛场并对乳房炎奶牛患乳区的乳样进行细菌学检测，分离出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌，同时采集当地生长的银杏叶，采用中药常规的煎煮法提取其有效成分，对耐抗生素的病原菌进行体外抑菌试验，从而为防治奶牛乳房炎和开发利用银杏叶提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

采集江苏省不同地区的3个奶牛场临床型乳房炎和隐性乳房炎奶牛患乳区的乳样。

银杏叶来源于南京市幕府山，从5-11月份，每月15号采摘，共采7次。洗净、晾干、干燥、粉碎，然后密封储存于广口瓶中备用。

1.2 培养基、试剂与仪器

普通营养琼脂培养基（NA）、麦康凯培养基（MA）、甘露醇培养基（MSA）、伊红美兰培养基、营养肉汤（均为杭州滨和微生物试剂有限公司生产，批号分别为20200105、20200711、20201223、20200928、20200312），5%血琼脂培养基（100mL普通营养琼脂中加入5mL兔血）。肠杆菌科生化鉴定管、葡萄球菌属生化鉴定管、链球菌生化鉴定管（杭州滨和微生物试剂有限公司生产，批号分别为20200805、20200290、20200420）及实验室常用试剂。离心机、恒温培养箱、超净台、电炉等实验室常用仪器设备。

1.3 试验方法

1.3.1 乳样采集

采样前先用温水清洗乳头，再分别用2%碘液和75%酒精进行消毒，在每次清洗或消毒乳头后均用消毒纸巾擦干。弃去采样乳区的头3把奶，然后采集约10mL乳样于灭菌试管中，加盖封紧，并作好标记，置于附有冰袋的采样箱内带回实验室备用。临床型乳房炎判定标准：乳房有明显的炎症症状，乳区出现红肿热痛，挤奶时奶牛抗拒，挤出的奶样中有絮状沉淀或颜色变化。隐性乳房炎判定标准：DHI检测乳汁中体细胞数超过50万个/mL，患病奶牛无临床症状。

1.3.2 细菌分离培养鉴定

采取乳样5mL，接种于5%兔血清肉汤中，置37℃培养24h。再将培养物分别接种于甘露醇、麦康凯和血琼脂培养基上，置37℃培养24h。

在甘露醇培养基上挑取湿润、光滑、隆起的金黄色圆形菌落涂片，革兰氏染色阳性者，镜检，初步鉴定为金黄色葡萄球菌。同时将相同的菌落接种到5mL营养肉汤中置37℃摇床中1 500r/min培养6～12h，再接种于普通营养琼脂平板37℃培养18～24h后，接种于乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等微量生化鉴定管，进行葡萄球菌属生化鉴定。分离鉴定得到金黄色葡萄球菌。

在麦康凯培养基上挑取红色菌落涂片，革兰氏染色为阴性者，镜检，初步鉴定为大肠杆菌。同时将相同的菌落接种于伊红美兰培养基，置37℃培养24h，再选取伊红美蓝培养基上黑色带金属闪光的菌落接种到营养肉汤中，置37℃摇床中1 500r/min培养6～12h。再接种于普通营养琼脂平板37℃培养18～24h后，接种于乳糖、葡萄糖、三糖铁斜面、麦芽糖、靛基质等微量生化鉴定管，进行肠杆菌科生化鉴定。分离鉴定得到大肠杆菌。

在血琼脂培养基上挑取溶血（α或者β）、灰白色、有乳光、表面光滑、边缘整齐、直径0.5～0.75mm的细小菌落涂片，革兰氏染色为阳性者，镜检，初步确定为链球菌。然后，将相同的菌落接种5%血清肉汤，置37℃摇床中1 500r/min培养6～12h，再接种于血琼脂培养基37℃培养18～24h，接种于蔗糖、葡萄糖、三糖铁斜面、麦芽糖、靛基质等微量生化鉴定管，进行链球菌生化鉴定。分离鉴定得到链球菌。

1.3.3 血浆凝固酶试验

据葡萄球菌的鉴定结果，取若干支小试管，加1:4稀释的新鲜兔血浆0.5mL，取一支加待检菌肉汤培养物0.5mL作阳性对照，取一支加生理盐水作阴性对照；置37℃水浴锅中水浴，每隔30min观察一次结果，若3～4h内试验管的阳性对照管出现凝固，阴性对照管不凝固，判为阳性。

1.3.4 触酶试验

在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧化氢中观察变化，30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性，鉴定链球菌。

1.3.5 试验菌液准备

取菌液500μL，接种于5mLLB培养液中，37℃、1 500r/min连续摇荡培养5～6h，细菌计数，使菌液浓度为107cfu/mL，4℃保存，以待备用。

1.3.6 银杏叶有效成分提取

取干燥银杏叶碎片30g，转移至1 000mL圆底烧瓶中，然后加入300mL（×10倍量）蒸馏水浸泡2h，再加热煮沸1h，然后用无菌干燥的6层纱布滤出液体，再加入180mL（×6倍量）蒸馏水，以60℃恒温煎煮1h，6层无菌纱布再次过滤，将两次滤液合并，60℃恒温将药液浓度浓缩至1g/mL，放入4℃保存，以待备用[4]。

在做抑菌试验前，取出上述水提液，向其内加入无水乙醇，直至无水乙醇在混合液中的浓度为70%，封口，静置，4℃过夜冷藏24h后取出，以3 000r/min的转速离心10min，取其上清液，再向其内加入无水乙醇，直至无水乙醇在混合液中的浓度为80%，封口，静置，4℃过夜冷藏24h后取出，以3 000r/min的转速离心10min，取其上清液，60℃恒温使其多余的酒精蒸发掉，最后加蒸馏水定容至1g/mL，封瓶，流通灭菌30min，放入4℃保存，以待备用[5]。

1.3.7 银杏叶提取物抑菌试验

向相应培养基中注入50μL菌液（菌液浓度为107cfu/mL），涂匀，干燥3～5min后，采用平板打孔法，以直径6mm为标准，在培养基上均匀打出3个孔并标记，将培养皿底部微微对准酒精灯火焰，加热封底，然后吸取浓度为1g/mL的银杏叶药液50μL，分别做3次重复。放入4℃静置2～4h（即待药液全部吸收），然后置37℃培养24h。测量抑菌圈直径d[5]。以抑菌圈直径（d）＞20mm为极敏，15mm＜d≤20mm为高敏，10mm＜d≤15mm为中敏，d≤10mm为低敏[6]。

1.3.8 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定

取灭菌试管10支，编号，于1～9管中各加入无菌肉汤培养基2mL，然后于第1管中加入1g/mL的药液2mL，混匀后取出2mL加入第2管，依此类推，直到第8管中取出2mL弃去，第9管为肉汤对照，第10管为药液对照。然后1～9管加入菌液0.1mL，摇匀，置37℃恒温箱中培养18h。以不发生混浊变化的最高药物稀释倍数为该药物的MIC值。将所有清晰无细菌生长的试管营养液接种于营养琼脂培养基和血液培养基，培养24h，以菌落数不超过5个的最低药物浓度为该药物的MBC值[7]。

2 结果与分析

2.1 奶牛乳房炎乳汁中的细菌分离鉴定结果

从3个奶牛场中选取的奶牛乳房炎患乳区的乳样中，经细菌分离培养鉴定、血浆凝固酶试验和触酶试验共计筛选出43株金黄色葡萄球菌、35株大肠杆菌、26株链球菌。

2.2 银杏叶提取物对病原菌的体外抑菌效果

分别选择有代表性的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌各15株，编号1～15，做抑菌试验，结果见表1。结果表明，不同月份银杏叶提取物对不同的菌种抑菌效果不同，对相同的菌种不同的菌株抑菌效果不同；相同月份银杏叶提取物对不同的菌种抑菌效果不同，对相同的菌种不同的菌株抑菌效果也不同。银杏叶提取物对大肠杆菌的最大抑菌圈是20mm，其中秋季（9～11月）提取物对其15株菌均为高敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范围内；对金黄色葡萄球菌最大抑菌圈是22mm，9月份提取物对其有4株极敏，6株高敏，5株中敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范围内；对链球菌最大抑菌圈是24mm，9-10月份提取物对其有13株极敏，2株高敏，其他月份抑菌圈均在低敏到高敏范围内。结果表明，9月份银杏叶提取物对三类菌的抑菌作用普遍比其他月份强。本试验中，银杏叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的极敏抑菌圈直径分别为20mm、22mm、24mm，由此可知银杏叶提取物对致病菌的抑菌作用为：链球菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

表1 不同月份银杏叶对各种菌的抑菌试验结果 单位：d（mm）

2.3 银杏叶提取物对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)测定结果

不同月份采集的银杏叶，其提取物对乳房炎的3种主要致病菌均有不同程度的抑制作用。5-11月的银杏叶提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）范围在31.25mg/mL～250mg/mL之间；对金黄色葡萄球菌和链球菌的最小抑菌浓度（MIC）范围均在31.25mg/mL～125mg/mL之间。7个月份采集的银杏叶提取物，9月份的抑菌作用最强，其次为10月、11月份。结果见表2。由此可知，银杏叶采摘的最佳时间应该是秋季，尤其是9月份。

表2 银杏叶提取物对病原菌的最小抑菌浓度 单位：mg/mL

2.4 银杏叶提取物对病原菌的最小杀菌浓度(MBC)测定结果

不同月份采集的银杏叶提取物对奶牛乳房炎的3种致病菌均有不同程度的杀灭作用。5月至11月的银杏叶提取物对大肠杆菌的最小杀菌浓度（MBC）范围在62.5mg/mL～500mg/mL之间；对金黄色葡萄球菌和链球菌的最小杀菌浓度（MBC）范围均在62.5mg/mL～250mg/mL之间。且对致病菌的杀灭作用为：链球菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌，最小抑菌浓度均低于最小杀菌浓度一个梯度，说明银杏叶提取物的抑菌效果比较稳定。结果见表3。

表3 银杏叶提取物对病原菌的最小杀菌浓度 单位：mg/mL

3 小结与讨论

3.1 本试验从乳房炎奶牛的患乳区乳汁中分离得到大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌。应用银杏叶提取物做病原菌抑菌试验，结果表明，银杏叶提取物对链球菌抑菌作用最强，其次是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。最大抑菌圈分别是24mm、22mm和20mm，9-10月份银杏叶提取物对链球菌有13株极敏，2株高敏；9月份银杏提取物对金黄色葡萄球菌有4株极敏，6株高敏，5株中敏；9-11月份银杏叶提取物对大肠杆菌15株均为高敏；最小抑菌浓度均为31.25mg/mL，最小杀菌浓度均为62.5mg/mL。由此得出结论：秋季的银杏叶提取物对奶牛乳房炎致病菌的抑菌效果最好，尤其是9月份的银杏叶提取物。

3.2 据报道[8]银杏叶中含有黄酮苷、萜内酯、多糖、聚戊烯醇衍生物等多种生物活性成分并随季节变化。本次试验在研究银杏叶提取物对奶牛乳房炎主要致病菌抑菌效果的基础上比较了不同月份其提取物抑菌效果的差异。结果发现，不同月份采集的银杏叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌效果不同。本研究结果中银杏叶提取物抑菌效果强于李焰[9]、何克新[10]、周彦[11]等试验的抑菌效果。这种差异可能是由海拔高低、太阳光及紫外线辐射强度、大气温度、昼夜温度、空气湿度、土壤温度、水分状况及地区差异和银杏叶生长年限等协同作用引起[12～14]。

3.3 试验过程中发现，前期用以提取银杏叶有效成分的温度对抑菌效果具有较为明显的影响。开始以65℃提取银杏叶有效成分，结果无抑菌作用，后查找相关文献，分别设75℃、85℃和95℃为提取温度，经过对比，结果表明在95℃条件下，银杏叶提取物的抑菌效果最好。今后可对银杏叶有效成分提取温度做进一步探讨。

3.4 本次试验表明，银杏叶对奶牛乳房炎致病菌在体外有不同程度的抑制和杀灭作用，但其体内抑菌效果还有待进一步试验进行观察研究，只有体内和体外抑菌效果一致且稳定，才能确定银杏叶对奶牛乳房炎致病菌具有抑制和杀灭作用。本试验初步表明，银杏叶在防治奶牛乳房炎上具有可以期待的应用前景，以其为原料可以开发出价格便宜、作用广泛的奶牛用中草药制剂来取代长期广泛使用的化学药物和抗生素，以使中草药在奶牛乳房炎防治方面发挥更大的作用，逐渐实现绿色养殖并生产无抗生素的优质奶。