郑州地区致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离鉴定、耐药性及耐药基因检测

王申锋，钱明珠,2，程 征，化 军，朱红标，谢军强，王德刚

(1.河南农业职业学院牧业工程学院，河南郑州 451450; 2.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130012;3.河南健恒动物药业有限公司，河南郑州 451476；4.郑州航空港经济综合试验区社会事业局，河南郑州 450019；5.汤阴县畜牧兽医总站，河南汤阴 456150)

近年来，随着奶牛养殖数量的增加，乳房炎发生与流行呈现逐年增高的趋势，且成为危害奶牛严重的疾病之一，严重影响奶牛养殖的经济效益。据统计，规模化养殖场中该病的发生率在20%以上，其他散养奶牛场该病发病率在50%以上，该病成为奶牛养殖过程中常见疾病，给奶牛养殖带来了巨大的经济损失[1-2]。因此，应该注意奶牛乳房炎的综合防控。临床中多种病原菌均可以引起奶牛乳房炎，以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)最为常见，该菌成为引起牛乳房炎主要病原菌之一[3]。金黄色葡萄球菌可以引起多种动物和人发病，是临床中常见的人兽共患病原菌之一，分布广泛(如空气、土壤、食品等)，感染金黄色葡萄球菌后，临床中以败血症、化脓性感染、乳房炎、子宫内膜炎等为常见[4-5]。金黄色葡萄球菌是导致食物中毒重要的食源性病原菌，该菌主要存在于乳制品中，生鲜牛奶成为该菌主要的潜在载体[6-7]。因此，对生鲜牛奶的检测具有重要的意义。临床中金黄色葡萄球菌防治主要以抗菌药物为主，随着抗菌药物的滥用，导致金黄色葡萄球菌耐药菌株逐渐增多，对牛奶品质和人们的健康存在潜在的威胁[8]。许多研究表明，金黄色葡萄球菌耐药性的产生与其携带耐药基因有关，耐药基因的变异与表达，可以增加其耐药性。本试验对2019年-2020年采集自河南郑州地区奶牛养殖场及散养户中疑似患有乳房炎的鲜奶样品，进行金黄色葡萄球菌分离鉴定，对得到的分离株检测其致病性、耐药表型及耐药基因，为该病的综合防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2019年-2020年采集自郑州地区规模化奶牛场及散养户中疑似患有乳房炎的鲜奶样品，进行金黄色葡萄球菌分离鉴定。

1.1.2 主要试剂 70 mL/L绵羊血脱纤培养基，购自上海卒瑞生物科技有限公司；普通营养肉汤、金黄色葡萄球菌鉴别培养基(甘露醇氯化钠琼脂鉴别培养基)，青岛日水微生物科技有限公司产品；阳性菌鉴定试纸条，法国梅里埃公司产品；药敏纸片，常德比曼生物科技有限公司产品；2×TaqMarker Mix，北京酷来搏科技有限公司产品； DNA标准DL 2 000，北京迈瑞达科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 半自动细菌鉴定系统(K-3401型)，法国生物梅里埃股份有限公司产品；多功能梯度PCR仪(TC9600-G型)、凝胶成像仪(GelDocTMXR+型)，美国Bio-Rad公司产品；双人超净工作台(SW-CJ-2FB型)、细菌恒温培养箱(px-70型)，苏州净集团安泰公司产品。

1.1.4 实验动物 25 g左右的健康昆明系小鼠465只，由河南农业职业学院牧业工程学院实验动物中心提供。

1.2 材料

1.2.1 细菌分离培养 无菌条件下，对采集的鲜奶样品进行分装和处理，处理的鲜奶样品接种于70 mL/L绵羊血脱纤培养基37 ℃恒温培养12 h～24 h，挑取单个菌落接种于金黄色葡萄球菌鉴别培养基上(甘露醇氯化钠鉴别培养基)上进行鉴别培养，接种在普通营养肉汤中纯化培养，并染色镜检。

1.2.2 细菌生化试验 对甘露醇氯化钠鉴别培养基分离菌株，参照阳性菌鉴定试纸条说明书对分离菌株进行生化试验鉴定。

1.2.3 细菌的PCR鉴定 采用水煮法提取初步鉴定为金黄色葡萄球菌分离菌株的基因组DNA，参考文献[8]报道金黄色葡萄球菌特异鉴定引物femB基因，引物由华大基因公司合成，以提取的金黄色葡萄球菌分离菌株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定， PCR鉴定的阳性菌株的产物送华大基因公司测序，测序结果根据GenBank登录的参考株进行同源性对比。

1.2.4 动物致病性试验 采用人工感染小鼠的方法进行分离菌的致病性试验，将分离的92株金黄色葡萄球菌分离菌株进行纯化培养至对数期计数为108CFU/mL，每株分离菌通过腹腔注射方式攻毒5只小鼠，剂量为0.25 mL，未攻毒组腹腔注射等量的无菌的PBS，每株分离菌株攻毒12 h后，隔离饲养观察6 d，记录发病及其死亡情况。

1.2.5 药敏试验 参照标准K-B纸片法对分离的致病性金黄色葡萄球菌进行药敏试验和结果判断，统计数据,分析其致病性金黄色葡萄球菌的耐药性。

1.2.6 细菌耐药基因检测 参考文献[9-10]，设计15种耐药基因引物(表1)，其中四环素耐药基因4种(tetK、tetL、tetM、tetO)，β-内酰胺类1种(blaZ)、大环内酯类耐药基因6种(ermA、ermB、ermC、linA、msrA、mphC、aac6-aph2)，多重耐药基因(cfr、fexA、fexB)用梯度PCR对分离菌株进行耐药基因检测，并统计结果。

表1 引物序列

续表1

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

疑似金黄色葡萄球菌的菌株在70 mL/L脱纤绵羊血培养基菌落呈现β溶血；在甘露醇氯化钠琼脂培养基上长出浅黄色菌落；染色镜检可见单个短链、成堆串状排列的革兰氏阳性球菌。

2.2 细菌生化鉴定结果

根据细菌的分离鉴定结果进行生化试验，结果显示，92株分离菌株生化试验初步鉴定为金黄色葡萄球菌分离株。与《伯杰氏细菌鉴定手册》中生化特性基本上一致。

2.3 细菌的PCR鉴定结果

初步鉴定为金黄色葡萄球菌92株分离株用特异鉴定引物femB进行进一步鉴定，由图1可知，92株分离菌株均扩增出大约为651 bp大小的目的基因femB片段，测序结果与GenBank中金黄色葡萄球菌参考株同源性比对同源性均大于98.9%，从分子水平上鉴定为金黄色葡萄球菌。

M.DNA 标准DL 2 000;1～6.临床分离菌株; 7.空白对照

2.4 动物致病性试验结果

攻毒后小鼠在攻毒试验期间表现出精神沉郁、采食量减少及急性死亡等不同的临床症状，从死亡的试验小鼠体内分离到攻毒菌株(金黄色葡萄球菌)，直到攻毒试验结束，未攻毒的小鼠未出现临床症状。不同的分离菌株对试验小鼠具有不同的致病性，其中致小鼠死亡4/5只、5/5只菌株最多，分别占分离菌株的34.7%、44.4%。

2.5 药敏试验结果

对分离的75株致病性金黄色葡萄球菌进行药敏试验，结果表明，分离的75株沙门菌耐药性严重，对链霉素、阿莫西林、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、氟苯尼考、阿米卡星、磺胺间甲氧嘧啶、红霉素9种药物耐药率较高，耐药率在77.3%～98.7%之间；对多西环素、环丙沙星、氨曲南、大观霉素、多黏菌素5种药物的耐药率在45.3%～64.0%之间；对头孢噻呋、头孢噻肟、恩诺沙星、林可霉素耐药率在13.3%～22.7%之间(表2)。

表2 75株致病性金黄色葡萄球菌耐药性分析结果

2.6 多重耐药性分析结果

由表3可知，临床中分离的75株金黄色葡萄球菌呈现多重耐药性，耐17种药物有1株、耐16、7种药物各3株，耐15、9、6种药物各4株，耐14、8种药物各有6株，耐13种药物有5株，耐12、11、10种药物分离菌株最多，分别占分离菌株的16.0%、18.7%和17.3%。

表3 多重耐药性检测结果

2.7 毒力基因检测

结果由4可知，分离菌株的耐药基因blaZ、ermA、ermB、tetK、tetL、cfr、fexA、fexB检出率较高，在30.7%～82.7%之间；耐药基因linA、msrA、aac6-aph2、tetM检出率在2.7%～13.0%之间；耐药基因ermC、mphC、tetO未检出。

表4 75株致病性金黄色葡萄球菌耐药基因检测结果

3 讨论

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，在奶牛养殖过程中，饲养管理不当、挤奶及环境未进行消毒等因素，可致该菌入侵奶牛乳房中，在乳腺细胞上生长、繁殖引起炎症、严重引起乳房炎[11-13]。因此，奶牛场中应该注重该病的综合防控。本研究结果表明，从2019年-2020年采集的鲜奶样品127份中分离得到92株分离株，其中75株金黄色葡萄球菌对小鼠具有致病性，以致小鼠死亡4/5只、5/5只菌株最多，说明该地区奶牛源金黄色葡萄球菌流行严重，且具有很强的致病性。因此，在奶牛养殖过程中应该引起重视，对该病进行综合的防控。

临床中奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌防治主要依靠抗菌药物治疗，由于抗菌药物的滥用，导致其金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，其耐药性也逐年增加，给该菌的防治带来一定困难[9-11]。本试验结果表明，75株金黄色葡萄球菌分离菌株对临床中常用的14种药物耐药率在45.3%以上，产生了很强的耐药性，且呈现多重耐药性，耐12(16.0%)、11(18.7%)、10(17.3%)种药物分离菌株最多。说明该地区分离的75株金黄色葡萄球菌对常用的抗菌药物产生很强的耐药性，且呈现多重耐药性。与张行等[9]、李托等[14]、万佳宏等[15]报道的金黄色葡萄球菌耐药性存在一定差异性，与地区、环境及用药频率等多种因素有关。金黄色葡萄球菌耐药性已经较普遍，且在治疗该病过程中一定合理使用药物，减少耐药性产生，同时加强饲养管理，注意环境的消毒。

国内许多研究表明，金黄色葡萄球菌的耐药菌株通常通过携带多种耐药基因快速适应生存环境中抗菌药物的使用频率而产生耐药性，在金黄色葡萄球菌基因组编码中含有多种可移动的遗传元件，其携带耐药基因通过其水平基因的转移而发生进化，调控各种耐药因子的表达产生耐药性，金黄色葡萄球菌的耐药菌株产生与其携带耐药基因具有一定相关性[15-17]。本试验结果表明，75株金黄色葡萄球菌携带12种耐药基因，耐药基因blaZ、ermA、ermB、tetK、tetL、cfr、fexA、fexB检出率在30.7%以上，其他耐药基因检出率在2.7%～13.0%之间,说明该地区分离的75株金黄色葡萄球菌携带多种耐药基因。携带耐药基因与耐药性之间的相关性及产生耐药机理尚未明确，有待进一步研究。本试验结果可为该地区奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的综合防控提供参考。