3种肌酸激酶同工酶MB活性试剂抗溶血干扰能力的比较

张文娟，胡敏，张婷婷，陈若虹（中南大学湘雅二医院检验科，长沙410011）

肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）是一种为人熟知的心肌损伤标志物。有临床医生咨询CK-MB活性检测结果与临床表现不符的原因，经核实发现样本有轻度溶血，导致结果假性升高。样本溶血在日常工作中并不少见，溶血时，红细胞破坏，细胞内容物释放，可通过光学干扰以及与试剂成分发生化学反应等机制使检验结果假性升高或降低［1］，最佳处理方式为重新抽血，但联系临床重新抽血会延长检验结果报告时间，而且部分患者重新抽血困难较大。《临床标本溶血检测与检验结果报告专家共识》［2］建议实验室应验证检验项目的溶血干扰阈值，即溶血造成的检验结果改变超出允许偏差时的标本血红蛋白浓度，常以溶血指数（haemolytic index，HI）表示，当标本HI低于检验项目的溶血干扰阈值时，实验室可以报告检验结果，因此提高检测系统的溶血干扰阈值，即抗溶血干扰能力，也是应对溶血的有效手段。本研究对3种不同品牌的CK-MB活性检测试剂进行溶血干扰实验，以了解溶血对CK-MB活性检测的干扰程度，并寻找有较强的抗溶血干扰能力的试剂。

1 对象与方法

1.1 标本来源 收集2021年5月中南大学湘雅二医院患者血清标本40份，CK-MB浓度分布在3～150 U/L范围内，同时收集CK-MB接近医学决定水平25 U/L和90 U/L的2份血清标本，所有标本均无脂血、溶血及黄疸。

1.2 主要仪器与试剂 7600型全自动生化分析仪（日本日立公司），XN-20型全自动血细胞分析仪（日本希森美康公司），CK-MB活性检测试剂盒及配套校准品、质控品（宁波美康公司、罗氏公司以及日本关东化学公司）。

1.3 实验方法 检测前确保仪器性能正常，使用试剂盒配套的校准品校准仪器（两点法定标）并检测配套的双水平质控品，质控结果均在控后才开始检测。

1.3.1 溶血前后的比对 40份血清样本用3种试剂分别检测CK-MB活性及HI 2次，检测完成后，将样本随机分成3组，样本数分别为14、13、13，用洁净玻璃棒搅拌试管底部红细胞，1～3组的搅拌时间分别为10、20、40 s，造成不同程度的溶血，离心后重新检测CK-MB、HI以及血红蛋白浓度，比较溶血前后CK-MB的差异以及分析偏差与HI的关系。

1.3.2 溶血干扰实验 取血细胞分析检测结果全为正常的EDTA-K2抗凝血一份，离心后去上清液，加入用生理盐水洗涤的红细胞，离心后去上清液，重复洗涤3次，加入去离子水并充分震荡使红细胞裂解，离心后取上清液作为溶血干扰母液。依据EP7-A2［3］的方法，收集CK-MB活性接近医学决定水平25 U/L和90 U/L血清标本，在标本中加入溶血母液制备成干扰高值样品，加入等量的去离子水制备成干扰低值样品，加入体积不超过总体积的10%。用血细胞分析仪检测干扰高值样品的血红蛋白浓度，重复检测3次取均数。干扰低值（L）和高值（H）样品按L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、H的比例混合，配制成不同浓度梯度的干扰血清。每份样品测定CK-MB及HI 3次取均值，计算干扰样品中血红蛋白浓度以及CK-MB的偏差。

1.4 统计学分析 非正态分布计量资料用M（P25，P75）表示，溶血前后的差异比较采用配对t检验，采用线性回归分析偏差与HI的关系。采用Excel 2016和SPSS 22.0统计软件对数据进行统计分析和作图，以P＜0.05为有统计学意义，溶血造成结果偏差的允许范围设为10%。

2 结果

2.1 溶血前后结果的比较 40例样本溶血前HI均为0，溶血后HI为2～20，差异有统计学意义（t＝7.475，P＜0.01），用血细胞分析仪检测溶血后血清中的血红蛋白约为0～600 mg/dL。对溶血前后的CK-MB检测结果作配对t检验，关东试剂的差异无统计学意义（t＝0.033，P＝0.974），美康（t＝6.966，P＜0.01）和罗氏（t＝7.824，P＜0.01）的差异均有统计学意义。3种试剂检测溶血前及溶血后的CK-MB活性、偏差和HI见表1。将溶血前后CK-MB的绝对差值与HI作线性回归，回归方程及相关系数见图1。

表1 溶血前后检测结果的比较［M（P25，P75）］

图1 溶血前后CK-MB差值与HI的散点图

2.2 溶血干扰实验 在血细胞分析仪上测得干扰高值样品中的血红蛋白浓度为500 mg/dL。干扰低值与干扰高值样品按不同比例混合后得到血红蛋白浓度呈梯度排列的5个样品，计算得到样品中血红蛋白浓度分别为：0、125、250、375、500 mg/dL。分别用3种试剂检测干扰样品中的CK-MB活性3次，以血红蛋白浓度为0的样本为对照样本，计算各样本的CK-MB活性均值以及与对照样本的偏差，结果见表2。

表2 干扰样本中CK-MB活性的均值及与对照样本的偏差

3 讨论

本研究分析的溶血干扰由红细胞裂解产生，模拟了日常工作中的真实情况，缺点是干扰物的成分及浓度难以确定，因为除了红细胞外，其他血细胞如白细胞、血小板等细胞的内容物也会释放出来，还有由干扰母液带入的外源性干扰，使得干扰因素复杂化，但本研究的目的是比较不同试剂的抗干扰能力，由于所有样本都是用3种试剂同时检测，干扰条件对3种试剂来说都是相同的，因此可暂不分析具体是哪些物质造成的干扰，如果在多种干扰因素同时存在的情况下，偏差仍然在允许范围内，更能反映该试剂的抗干扰能力优秀。细胞裂解后释放的干扰物总量，应该与血红蛋白的浓度成正比，因此我们同时检测了溶血指数和血红蛋白浓度，可间接反映血细胞裂解后各种干扰物的浓度。

溶血前后CK-MB活性的比对结果显示，美康和罗氏的检测结果在溶血后明显升高，差异有统计学意义。通过控制搅拌时间，40份血清HI呈梯度排列，溶血后的偏差与HI呈线性正相关，说明溶血越严重，偏差越大。而关东试剂溶血后的结果与溶血前比较，差异无统计学意义，表1和图1显示CK-MB溶血前后的差异远小于其他2种试剂，绝对偏差在-5.2～6.6 U/L之间，且与HI无明显相关性。

溶血干扰实验显示，几乎所有的美康和罗氏的干扰样本的偏差均超过了10%，而且随着血红蛋白浓度增加，偏差也随之增大。而对于关东试剂，低值样本在血红蛋白为250 mg/dL，高值在血红蛋白为500 mg/dL时，其检测结果的偏差仍未超过10%的设定目标，抗干扰能力远强于其他两种试剂。

CK-MB作为一种经典的心肌损伤标志物，被各大临床诊疗指南［4-7］推荐，它对心肌损伤的时间判定和检出早期再梗死有重要价值［8］。CK-MB可以通过特异的单克隆抗体检测质量［9］，干扰因素少但成本较高，CK-MB活性检测成本低廉，仍是目前常用的检测方法。目前CK-MB活性检测多为免疫抑制法，有较多干扰因素，血红蛋白引起的光学干扰可以通过样品空白、双波长等方法消除，其他已知的干扰物质主要有血清中的CK-BB、巨CKⅠ、巨CKⅡ以及红细胞中的腺甘酸激酶（Adenylate Ki-nase，AK）等，CK-BB含有B亚基，巨CKⅠ被免疫蛋白包裹，均难以消除，巨CKⅡ可通过特异性抗体屏蔽［10］，AK可通过添加抑制剂以及双项同测［11］等方法消除干扰，但大多数厂商并未采取相应措施［12］。关东试剂采用双试剂、双波长以及双动力反应模式消除溶血引起的干扰，效果明显。双动力反应模式的抗干扰原理与双向同测法［11］类似。