负载抗菌肽的聚乳酸纺丝纤维体外药物缓释性能及抗菌性研究

谢宁，李慧，孙芸芸，张晗，朱宪春

(吉林大学口腔医院正畸科，吉林 长春 130021)

阻生齿指已过萌出期却在颌骨组织中未萌出的牙齿，上颌前牙阻生对面部美观的影响较大且会影响咀嚼功能，这对患者的生活和心理健康等会造成负面影响[1]。目前，治疗上颌骨内埋伏阻生齿最常用的方法是正畸-外科联合治疗[2]。而对于阻生位置较深的患者，需先行开窗减压术来消除囊性病变，待其经术前设计的萌出通道自行萌出一段距离后再行助萌术[3]。同时，聚乳酸(PLLA)常被作为聚合物的基质或药物载体等用于临床实践中[4]。并且，熔融纺丝技术是目前制备PLLA纤维最常用且较简便的方法[5]，但作为一种植入材料，它疏水和非极性的表面特性不利于细胞黏附，且它本身并不具备抗菌性能，故需对其进行表面改性[6]。而抗菌肽(AMPs)具备较好的抗菌活性，可用于临床治疗[7]。其次，HHC-36因其最低抑菌浓度(MIC)比抗生素低，细胞毒性和最低红细胞溶解度也非常低[8]，故可用于制备植入物涂层。本研究拟利用聚多巴胺(PDA)辅助抗菌肽结合至PLLA纤维制备一种具有持续稳定抗菌效果的改性材料，并研究其抗菌性及促细胞增殖潜能，以构建理想的创口填充材料。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

聚乳酸原材料(长春圣博玛生物公司)，抗菌肽(HHC-36，KRWWKWWRR，95%纯度，上海强耀生物公司)，丙酮(美国Sigma公司，179124)，无水乙醇(美国Sigma公司，459828)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(美国Sigma公司，159417)，胰蛋白酶(北京索莱宝公司，T1320)，胰蛋白胨大豆肉汤培养基(北京索莱宝公司，LA0110)，盐酸多巴胺(上海阿拉丁试剂公司，D103111)，杜氏改良伊格尔培养基(美国Thermo公司，10567014)，胎牛血清(美国Thermo公司，10091)，金黄色葡萄球菌(中国科学院长春应化所，25923)，大肠杆菌(中国科学院长春应化所，8739)，成骨细胞(中国科学院长春应化所，MC3T3-E1)，细胞增殖检测(CCK-8)试剂盒(上海碧云天生物公司，C0038)，青-链霉素(美国Sigma公司，V900929)，FITC(美国Sigma公司，FITC1)，DAPI(美国Sigma公司，10236276001)；X 射线光电子能谱分析仪(ESCALAB 250，美国Thermo公司)，多功能酶标仪(Infinite M200，瑞士Tecan公司)，扫描电子显微镜(XL-30，荷兰Philips公司)，恒温水箱(DK-420S，上海精宏公司)，真空干燥箱(D2F-6050，上海精宏公司)，水接触角测定仪(VCA 2000，美国AST公司)，真空冷冻干燥机(FD-1C-50，北京博医康公司)，微量移液器(Finnpipette F1，美国Thermo公司)，超低温冰箱(TLE50086A，美国Thermo公司)，超声波清洗仪(YL-040S，深圳语路公司)。

1.2 熔融纺丝法制备PLLA纤维

将干燥的PLLA颗粒加入到温度比PLLA聚合物的熔融温度高10 ℃的预热加热管中，并加热10～15 min。随后，通过加热管顶部注入氮气。当熔体均匀流出时，在纺丝喷嘴的下端加入热空气(450 ℃，高于聚合物的熔融温度)，PLLA的熔化物被高速热空气拉长，熔化物到达金属丝网收集器，此时即可得到PLLA纤维。

1.3 材料改性及分组

将PLLA纤维浸泡在聚多巴胺溶液(2 mg/mL)中，在低温条件下避光反应24 h，后用去离子水浸泡冲洗原材料3次，每次5 min，直至将表面未结合的聚多巴胺去除，此时材料仅有聚多巴胺接枝，记为PLLA/PDA纤维。将HHC-36溶解在无水乙醇中，制备浓度为1.5 mg/mL的溶液，用移液枪吸取抗菌肽溶液滴至洗净的PLLA/PDA纤维表面，使其润湿材料，后置于真空干燥箱中在36.5 ℃下真空干燥20 min，此过程重复10次。最后用PBS溶液轻柔冲洗改性材料，将其表面未结合的抗菌肽洗去，置于冷冻干燥箱中干燥24 h，该组材料为聚多巴胺辅助接枝HHC-36材料组，记为PLLA/DH-36纤维。

1.4 性能表征

1.4.1 扫描电子显微镜检测 使用扫描电子显微镜对PLLA纤维片、PLLA/PDA纤维片和PLLA/DH-36纤维片的表面形貌、尺寸进行观察，确定抗菌肽成功接枝到聚乳酸纺丝纤维上，使用NIH Image J软件分析材料纤维的直径大小分布。

1.4.2 XPS检测 使用能量色散X射线能谱仪检测PLLA纤维、PLLA/PDA纤维和PLLA/DH-36纤维中C、N、O元素的占比，检测三种材料中元素是否有含量的变化。

1.4.3 接触角测试 通过接触角测定仪检测接枝抗菌肽前后聚乳酸纤维水接触角，分析其亲水性。将PLLA纤维、PLLA/PDA纤维和PLLA/DH-36纤维压成薄片，平铺于洁净的玻璃板表面，使用接触角测量系统分别拍摄去离子水与各组材料即刻接触的图片及与材料接触5 s后的图片。

1.5 药物体外缓释试验

将抗菌肽溶于去离子水中，制备浓度梯度为2～100 mg/mL的19组溶液，在波长450 nm下使用比色皿测试每个梯度浓度溶液的光密度值(OD值)，作出抗菌肽含量的标准曲线。将PLLA/DH-36组材料置于PBS溶液中，在37 ℃恒温培养箱中于1500 rpm下震动培养30、90、150、270 min及24、72、120、168 h后测试其OD值，根据标准曲线计算抗菌肽的释放量，同时计算抗菌肽的释放速率。

1.6 抗菌性能测试

大肠杆菌(ATCC25539，中国科学院长春应用化学研究所)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923，中国科学院长春应用化学研究所)用作试验菌，以评估抗菌棉的体外抗菌活性。

1.6.1 细菌和材料共培养 分别取上述细菌悬浮液(1×108cfu/mL)100 μL置于96孔板中，将20 mg材料置于孔板菌液中，每组设3个平行样，在37 ℃恒温培养箱中混合培养。在培养30、60、90、150、270 min及18、24 h后分别测试其在600 nm波长下的OD值，计算3个平行样的平均OD值，表示菌液浓度。

1.6.2 抑菌环法 用LB液体培养基将S.aureus菌液稀释100倍，E.coli菌液稀释200倍后待用。在固体培养皿上涂布200 μL细菌悬浮液(1×108cfu/mL)，将三组材料置于培养皿上，37 ℃温育14 h。通过观察各组材料表面及周围有无细菌区来定性测定抗菌棉对细菌的抑制作用。

1.6.3 细菌活/死染色法 分别将三组材料制成直径为1 cm的样品后置于24孔板中，制备1×108cfu/mL的S.aureus菌液，用LB液体培养基将其稀释100倍后与样品在37 ℃恒温培养箱混合培养6 h，之后除去悬液，将样品用戊二醛溶液固定30 min，置于4 ℃冰箱中过夜保存。将固定好的样品用PBS溶液轻柔冲洗3次，去除表面悬浮的细菌。每组设3个平行样。用PBS溶液分别溶解活/死染色的两种试剂，每种试剂取150 μL，将两种试剂混合均匀后，取混合液加入含样品的孔板种，每孔加入20 μL，在37 ℃恒温培养箱中孵育30 min后置于荧光显微镜下观察细菌形态。

1.7 细胞相容性测试

按照体积比在DMEM培养基中加入1%双抗和10%胎牛血清制备H-DMEM培养基，用该培养基复苏MC3T3-E1细胞后，置于恒温细胞培养箱中培养。将各组样品经消毒处理后置于96孔板内，取处于对数生长期的细胞以每孔1.5×105个细胞的密度将其接种至96孔板上，于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中分别培养1、3、7 d，后用PBS溶液洗涤各孔3次，加入含有10 μL CCK-8的培养液100 μL孵育2 h，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度值，并将各组进行对照研究。每组样品设置3个平行样，且设置空白对照组。

1.8 统计学分析

所有数据使用Origin 8.0进行处理，使用SPSS 16.0统计软件对数据进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扫描电镜分析

使用直径为400 μm的喷丝头，接收距离为41.5 cm时，纤维直径较均匀且其表面光滑没有未熔融聚合物。用扫描电镜对各组纤维的形态和直径进行表征，图像分析软件Image J分析纤维直径的尺寸分布范围，约为8～16 μm。见图1。

2.2 XPS分析

用XPS分别对PLLA组、PLLA/PDA组、PLLA/DH-36组样品进行表征，观察材料表面的官能团及N、O元素的含量变化。如图2， PLLA组N含量为3.68%，PLLA/PDA组N含量为14.61%，PLLA/DH-36组N含量为17.08%。样品中N元素含量的上升证明聚多巴胺辅助抗菌肽接枝成功。

2.3 亲水性检测

去离子水液滴和纤维表面之间测得的接触角能反映材料表面润湿性。接触角值越小，表明材料表面的润湿性越高，亲水性也越强。如表1所示，在去离子水与样品即刻接触时，PLLA组纤维的水接触角为123.63°，PLLA/PDA组纤维的接触角为109.13°，而PLLA/DH-36组纤维的接触角为0°；去离子水与样品接触5 s后，PLLA组纤维的接触角为123.12°，而PLLA/PDA组纤维的接触角迅速下降为0°，PLLA/DH-36组纤维的接触角仍为0°。这表明了经改性的纤维表面亲水性增强，润湿性较好，有利于细胞黏附。

2.4 体外缓释行为

根据抗菌肽的释放实验结果显示，抗菌肽HHC-36在PBS溶液中能稳定释放，其释放量随时间变化而持续增加；释放速率初始时急速增大，在150 min时达至峰值，随后逐渐下降，3 d后速率趋于平稳。见图3。研究表明，在150 min内抗菌肽能完全发挥杀菌效果，抑制细菌的生长及增殖。

表1 样品的接触角表征

2.5 体外抗菌性能

微生物感染会阻碍创口愈合过程，因此纺丝棉具有抗菌能力十分重要。使用伤口感染的常见菌E.coli和S.aureus评估纺丝棉的抗菌能力。如图4及图5所示，细菌与材料共培养的结果，PLLA/DH-36组的细菌浓度始终保持在一个较低的水平，表明该组材料抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的效果较PLLA组及PLLA/PDA组显著；但是在抑菌环实验中，PLLA/DH-36组并没有产生期望中的抑菌环，与其他两组并无明显差异，这可能与用于抑菌环实验的材料表面较干燥，抗菌肽很难从其纤维表面游离出来而发挥抑菌效果有关，这说明PLLA/DH-36组材料的原位抗菌效果较好，不会产生全身毒性反应。细菌的活/死染色实验证明，PLLA/DH-36组材料表面的死细菌数量较PLLA组多，活细菌数较少，这也证明其具有良好的抗菌性能。见图6。

2.6 细胞相容性实验

对于填充材料来说，良好的细胞相容性是其必备的性能，本研究通过CCK-8实验定量评估3种材料的细胞毒性。如图7所示，培养1 d时，与空白对照组相比，3组材料的细胞增殖率均较低；在培养3 d时，与PLLA/PDA组相比，PLLA/DH-36组表现出细胞毒性，但它与PLLA组的细胞毒性无明显差异；在培养3 d后，3组材料的细胞毒性均表现出下降趋势，恢复其良好的生物相容性，细胞增殖速率高于空白对照组。该结果表示经PDA和HHC-36改性后的材料并没有改变PLLA纤维良好的细胞相容性，细胞毒性未增加。通过荧光显微镜观察经DAPI-FITC染色的材料发现，PLLA/DH-36组材料表面的细胞存活率与PLLA组并无明显差异，这与CCK-8实验的结果相似。见图8。

3 讨论

对于阻生尖牙的位置较深者，若直接行开窗助萌术则会造成较大创口。因此需利用外科中治疗囊肿时使用的开窗减压术，待其萌出到合适位置后再行助萌术，辅助阻生牙萌出到牙列正常位置[9]。但该愈合过程持续时间较长，需要定期冲洗创口、更换引流条来避免萌出道愈合和继发感染，这会给患者的生活造成不便[10]。为减轻患者的痛苦，缩短治疗时间，拟研究一种具有抗菌效果、可降解的填充材料应用到开窗减压术中。

抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的氨基酸肽，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌等的生长都具有良好抑制效果，且其发挥作用的速度很快。研究[11]表明，含抗菌肽的涂层可以通过接触杀死微生物细胞或通过局部释放其活性成分来防止生物膜的形成，且它可与抗微生物化合物的协同作用以达到抗生物膜感染的效果。它可以通过多重机制发挥抗菌性能，是抗生素的有效替代物[7]。其中HHC-36更是性能最强的短链肽之一，结构简单，可大规模制备，临床前景应用广泛。目前对用HHC-36修饰PLLA纤维表面的研究较少，对于其效果及相应的细胞毒性并不十分明确。贻贝启发性的多巴胺(DA)是人体内众所周知的一种神经递质，它可与多种物质结合，能在弱碱性溶液环境中，在氧气的参与下发生自聚合反应形成聚多巴胺(PDA)薄膜[12]。更重要的是，PDA薄膜可作为二级反应平台介导可控的多种大分子活性聚合反应，为PDA在表面改性方面的应用提供了基础[13]。以往有研究[14-15]证明，PDA可在多种材料表面形成涂层。目前 PDA自聚合机理尚未研究清楚，但是接枝药物是明确的。PDA分子中存在的儿茶酚基团，多巴醌结构和氨基基团，能够和活性药物的氨基，羧基等基团发生化学共价结合反应，从而将药物固定在材料表面[16-17]。同时因为PLLA纤维是具有三维立体结构的材料，其立体结构有助于聚多巴胺辅助抗菌肽在其表面的吸附。

本研究通过聚多巴胺将HHC-36接枝于PLLA纤维表面，通过其表面形貌等理化性能表征、抗菌性能、细胞相容性、动物实验等来评估改性纤维的性能。为PLLA仿生棉在医学填充材料领域的应用提供实验依据。实验结果显示，经电镜扫描后发现纤维直径较均匀且其表面光滑没有未熔融聚合物，说明聚乳酸纺丝纤维改性成功；其次，XPS检测显示PLLA组N含量为3.68%，PLLA/PDA组N含量为14.61%，PLLA/DH-36组N含量为17.08%，该结果表明样品中N元素含量的上升，亦证明聚多巴胺辅助抗菌肽接枝成功；另外，亲水性检测显示，在去离子水与样品即刻接触时，PLLA组纤维的水接触角为123.63°，PLLA/PDA组纤维的接触角为109.13°，而PLLA/DH-36组纤维的接触角为0°，去离子水与样品接触5 s后，PLLA组纤维的接触角为123.12°，而PLLA/PDA组纤维的接触角迅速下降为0°，PLLA/DH-36组纤维的接触角仍为0°，而去离子水液滴和纤维表面之间测得的接触角能反映材料表面润湿性，且接触角值越小，表明材料表面的润湿性越高，亲水性也越强，说明经改性的纤维表面亲水性增强，润湿性较好，有利于细胞黏附，这与之前研究[18]一致。

抗菌性能中，PLLA/DH-36组材料不能如其他研究产生较明确的的抑菌环，可能由于用于抑菌环实验的材料表面较干燥，抗菌肽不不能顺利从其表面游离出来所致，表明改性材料的原位抑菌效果较好，只会在植入局部发生抗菌反应，不会引起宿主较严重的全身反应。PLLA/DH-36对金葡菌和大肠杆菌的抑制效果均较好，在材料与菌液共培养的实验中，培养18 h时的细菌浓度较之前有小幅度上升，可能由于前后观察的时间间隔较久，细菌浓度有所提高，24 h时的细菌浓度较18 h继续下降也证明了改性材料在24 h时仍有抗菌效果。细菌活/死染色实验的结果不易观察的原因可能是PLLA/DH-36材料具有三维立体结构，细菌在该结构里附着，纤维交织处染色成团加深，不易看到单个较明显的细菌形态。这在扫描电镜观测材料表面细菌及细胞形态中也有发生，导致该部分观察结果缺如。在后续实验中可将材料压制成实片、在其表面接种细菌和细胞后再进行观测。细胞相容性实验表明，改性后的PLLA/DH-36组材料的细胞毒性较原始PLLA组材料并未增加，依旧保留PLLA纤维良好的生物相容性，而3 d内所观测到的细胞毒性可能由于AMPs的突然释放有关，说明PLLA/DH-36组材料具有良好的生物安全性，对于临床来说具有重要意义。

综上，作为一种高分子材料，经改性后的PLLA/DH-36具有良好的机械性能、抗菌活性、生物相容性等特点，对E.coli和S.aureus生长的抑制效果很好，可通过多种机制杀菌，而S.aureus是口腔环境的常居菌，可通过生物膜感染导致许多种慢性疾病，改性材料能对其发挥抑制作用，有利于它作为填充材料用于阻生齿导致的囊肿开窗减压术后。这种改性的PLLA/DH-36材料具有的良好性能为抗菌肽修饰纤维表面的基础研究奠定了基础，也为改性材料作为填充材料应用于口腔临床提供了科学依据。