生物炭溶解性有机质中不同分子量组分的分布及光谱特性

韦思业，范行程，毛 翰，操 涛，程 澳，范行军*，谢 越

1.生态环境部华南环境科学研究所，广东 广州 510530 2.广东省水与大气污染防治重点实验室，广东 广州 510530 3.安徽科技学院资源与环境学院，安徽 凤阳 233100 4.中国科学院广州地球化学研究所有机地球化学国家重点实验室，广东 广州 510640 5.中国科学院大学，北京 100049

引 言

生物炭(BC)是由生物质在缺氧或者无氧的环境下经过裂解得到的高含碳量的固体物质[1]。作为一种新颖的环境多功能材料，BC已被广泛应用于土壤改良和土壤修复等领域[2]。生物炭施加至土壤中会释放出大量的水溶性有机物(DOM)[3]，能够引起土壤中DOM的含量和性质发生改变[4]，同时对土壤有机和无机污染物的迁移转化亦产生重要的作用[5]。例如，BC DOM能吸附和催化降解有机污染物，促进土壤中疏水性有机污染物的溶解度和流动性[6]；BC DOM能与重金属发生强烈的络合作用，显著增加土壤中重金属的移动性[5, 7]。

本研究以我国产量较大的两类农业废弃物-稻秆(R)和猪粪(P)为生物质原料，分别在300，400和500 ℃裂解温度下制备得到生物炭。运用纯水萃取-过滤得到BC DOM，联合超滤技术分离出>5，1～5和<1 kDa三种分子量级组分。采用总有机碳分析仪、紫外-可见光光谱仪、三维荧光光谱-平行因子分析技术等对BC DOM及其分子量级组分的含量和光谱性质进行系统观测。本研究将有助于进一步了解BC DOM的分子量组成和结构特征，为准确评估BC DOM的环境行为提供重要的基础数据。

1 实验部分

1.1 样品制备

以稻秆和猪粪两种生物质作为制备生物炭的原料。稻秆采自广东省正果镇，猪粪采自四川省眉山市青神县养殖场。将稻秆经自来水洗净、猪粪去除石块等杂物后自然风干2 d，在75 ℃下烘干，用粉碎机粉碎，过50目筛后装密封袋备用。采用限氧升温炭化法制备生物炭样品。具体步骤[1]为：称取20 g备用生物质于陶瓷坩埚，压实盖上盖，并用锡箔纸包裹后在马弗炉中热解炭化。最高制备温度分别为300，400和500 ℃，升温速率为5 ℃·min-1，保留时间为4 h。自然冷却至室温后，将生物炭样品取出，研磨，过100目筛后分别密封保存。稻秆和猪粪生物炭样品分别标记为RX和PX(其中X代表炭化温度300，400和500 ℃)。

1.2 DOM提取及超滤分级

根据预实验选择合适的固液比(W/V)对生物炭与超纯水进行混合，放置于恒温振荡器中，在30 ℃，150 r·min-1条件下振荡24 h。然后在4 000 r·min-1下离心15 min，上清液过0.22 μm水系滤膜，所得滤液即生物炭DOM[1, 3]。利用总有机碳分析仪对DOM中的溶解性有机碳(DOC)进行测定。

采用Millipore-8050型超滤杯对生物炭DOM进行分子量组分分级。超滤分级前，将DOM的DOC稀释至20 mg·L-1左右以获得较优的分级效率。参考文献[11]，具体分级步骤：量取40 mL DOM置于超滤杯中，首先通过5 kDa超滤膜，超滤浓缩因子设为8，分别收集膜上浓缩液和膜下滤液，并分别定容至40 mL。按照相同方法将上述滤液通过1 kDa，收集浓缩液和滤液。最终得到DOM的3种分子量级份，包括>5，1～5和<1 kDa组分。每种类型生物炭DOM重复3次分子量分级实验。

1.3 仪器分析

采用岛津UV2600紫外-可见光(UV-Vis)光谱仪对生物炭DOM的UV-vis光谱进行测定，扫描范围为200～700 nm。选取α254表示DOM中发色团的相对含量[2, 9]，选取E2/E3表征DOM的相对分子质量[2]，选取SUVA254(L·mg-1·m-1)表征DOM的芳香度[1, 4]，计算公式如式(1)—式(3)

α254=2.303A254/l

(1)

(2)

(3)

式(1)—式(3)中，α254是波长为254 nm处的吸收系数，Ai是波长为i时的吸收值，c为DOC浓度，l为光皿长度。

采用日立F4600型荧光光谱仪测定DOM的三维荧光光谱(EEM)。激发(Ex)和发射(Em)波长扫描范围分别设为200～400和290～520 nm，扫描间隔均设置为5 nm，扫描速度为12 000 nm·min-1，PMT电压为700 V。利用超纯水作为空白对照，去除拉曼和瑞利散射对EEM谱图解析的干扰。引入区域体积积分(FRI)对生物炭DOM的荧光特征进行定量分析。根据He等[13]研究成果，将DOM-EEM谱图划分成6个区域，即富里酸类(A，Ex 200～275 nm，Em 380～520 nm)、腐殖酸类(C，Ex 275～400 nm，Em 380～520 nm)、低激发色氨酸类(S，Ex 200～250 nm，Em 330～380 nm)、高激发色氨酸类(T，Ex 250～300 nm，Em 330～380 nm)、低激发酪氨酸类(D，Ex 200～250 nm，Em 280～330 nm)、高激发酪氨酸类(B，Ex 250～300 nm，Em 280～330 nm)。

观测了3种荧光特征指数，包括荧光指数(FI)、腐殖化指数(HIX)和生物源指数(BIX)。计算公式[4, 8, 14]如式(4)—式(6)

(4)

(5)

(6)

1.4 数据处理

使用Excel 2016进行数据统计和分析，使用Origin2019b和CorelDRAW2018进行图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 生物炭DOM分子量分布特征

不同裂解温度下稻秆和猪粪生物炭DOM中的分子量组分DOC的含量分布如图1所示。由图1可看出，裂解温度在300～500 ℃之间时，稻秆和猪粪生物炭DOM中<1，1～5和>5 kDa组分的DOC含量分别为1.0～4.8和0.1～3.1，0.3～2.1和0.1～1.4，0.4～2.1和0.04～1.8 mg·g-1。随着裂解温度的升高，BC DOM的总DOC含量均呈现降低的趋势，与前期研究结果[1]及其他生物炭研究文献报道结果一致[2-3]。同时各级分子量DOM组分也表现为降低的趋势，即随着炭化程度的增加DOM分子量组分含量降低，表明高温对BC DOM中各级分子量组分均有强烈的裂解作用[2]。由于不同原料性质不同，随着裂解温度的增加，BC DOM分子量组分的含量降低程度也存在差异。由图1可明显看出，500 ℃下猪粪BC释放出的DOM非常少，说明该温度下猪粪BC炭化明显，释放的不稳定有机组分非常低[1, 3]。

图1 不同裂解温度下生物炭DOM不同分子量组分DOC含量

为进一步观测不同裂解温度下BC DOM的分子量分布，本研究分别利用DOC和α254来表征DOM的有机碳和发色团含量，具体结果见图2。以DOC计[图2(a)]，不同裂解温度下稻秆和猪粪BC DOM的DOC在<1，1～5和>5 kDa组分中的分布分别为42%～60%，16%～23%和23%～29%。由此可见不同裂解温度下BC DOM的DOC主要分布在小分子量组分(<1 kDa)中，说明裂解过程中主要生成了结构简单的小分子DOM[1-2]。重要的是低分子量的DOM容易被微生物利用[2]，因此BC DOM施加至土壤中会成为重要的碳源。以α254计[图2(b)]，不同裂解温度下稻秆和猪粪BC DOM的发色团在<1，1～5和>5 kDa组分中的分布分别为4%～27%，8%～9%和26%～81%。除P500以外，其余BC DOM中发色团主要分布在高分子量组分(>5 kDa)中，表明高分子量DOM主要以芳香族有机物组成为主[2, 9]。总的来说，裂解温度对于稻秆BC DOM的分子量分布影响并不显著；但是对于猪粪BC DOM的分子量分布影响较为明显。由图2(a，b)可看出500 ℃下猪粪BC DOM中1～5 kDa组分的DOC和α254百分比均有显著增加，而>5 kDa组分均显著减少，表明高度炭化的猪粪BC DOM以1～5 kDa组分组成为主。另一方面，综合图1和图2可发现，BC用于土壤修复中会释放出大量的低分子量DOC和高分子量发色团，但是随着裂解温度升高，释放量减小。

图2 生物炭DOM不同分子量组分的相对丰度比较

2.2 BC DOM分子量组分的UV-Vis光谱特征

不同裂解温度下稻秆和猪粪BC DOM中分子量级组分基于DOC校正的的UV-Vis光谱如图3(a—f)所示。BC DOM及其分子量组分的UV-Vis呈现出类似的光谱特征，其吸收值均随波长的增加而逐渐降低，主要因为BC DOM中含有大量的不饱和共轭双键和芳香族化学物[1]。这些特征与已报道的BC DOM的UV-Vis光谱特征相似[1, 8]。除P500以外，BC DOM中>5kDa比1～5和<1 kDa组分具有更强的光吸收特征，与α254结果一致，说明高分子量有机组分是BC DOM的主要吸光性物质。P500分子量DOM的UV-Vis特征则表明高温炭化后猪粪BC中DOM的发色团以中等分子量组成为主。

图3 BC DOM分子量组分的特征UV-Vis光谱

不同裂解温度下稻秆和猪粪BC DOM中分子量级组分的E2/E3和SUVA254分布特征如图4(a,b)所示。E2/E3是表征DOM分子量大小的特征参数，E2/E3值越大表明DOM分子量越小[1]。由图4(a)可看出，不同裂解温度下稻秆和猪粪BC释放出DOM的分子量组分的E2/E3大小均表现出一致的规律，即高分子量(>5 kDa)<中分子量(1～5 kDa)<低分子量(<1 kDa)。结果表明E2/E3可有效指示BC DOM的分子量分布。值得注意的是300和400 ℃下稻秆和猪粪BC DOM的E2/E3值差异不明显，但是均低于500 ℃下的BC DOM，与我们前期报道结果一致[1]。

图4 BC DOM分子量组分的E2/E3(a)和SUVA254(b)分布

SUVA254指示DOM的芳香性和分子量大小，SUVA254值越大，表明芳香族结构越多，分子量越大[1, 9, 15]。稻秆和猪粪BC DOM的SUVA254值分布在1.94～3.13 L·mg-1·m-1之间，由图4(b)可看出高温(400和500 ℃)裂解BC释放出的DOM比低温具有更高的芳香度和分子量，与文献报道结果一致[1]。在200～500 ℃制备得到的稻壳、木屑BC DOM也表现出类似的结果[14]。结果表明裂解温度对于BC DOM的分子量大小和芳香化程度具有重要的影响[1]。就分子量组分而言，不同裂解温度下BC释放出分子量DOM的SUVA254值均表现出一致的趋势，即高分子量(>5 kDa)>中分子量(1～5 kDa)>低分子量(<1 kDa)。该结果与E2/E3结果一致，间接表明SUVA254值可有效指示BC DOM中分子量组分的分布特征。值得注意的是，400和500 ℃裂解温度下，稻秆和猪粪BC中高分子量DOM的SUVA254值均未表现出显著的差异，但是均明显高于300 ℃下BC DOM中高分子量组分(>5 kDa)。此外，中分子量(1～5 kDa)BC DOM也表现出同样的规律。这些结果表明高温裂解BC释放出的高分子量和中分子量DOM组分比低温含有更多的芳香族结构。由图4也可看出稻秆和猪粪BC DOM的分子量组分结构存在显著的差异。不同裂解温度下，稻秆BC DOM的高分子量(>5 kDa)组分SUVA254值均高于猪粪，表明稻秆BC释放出的高分子量DOM具有更多的芳香族结构。然而，猪粪BC DOM的低分子量(<1 kDa)组分SUVA254值却高于稻秆，表明猪粪BC释放出的低分子量DOM比稻秆具有更高的芳香度。总之，不同裂解温度和生物质原料制备的BC释放出分子量DOM的组成和结构具有显著差异。

2.3 分子量BC DOM的EEM光谱特征

2.3.1 EEM光谱

EEM谱图可有效反映BC DOM的荧光物质组成特征[2, 8, 14]。以300 ℃稻秆和猪粪BC释放DOM及其分子量组分的EEM光谱为例(图5)。由图5可看出，稻秆和猪粪BC DOM分子量组分的EEM光谱均类似于整体DOM。其他温度条件下BC DOM及其分子量组分EEM均呈现出类似的特征。该结果表明BC DOM是一种分子量分散程度较高的连续体系，主要由不同“亚单位”结构通过弱结合力(如疏水作用、氢键、范德华力等)“自组装”而成[15]，并非离散物质体系。超滤分级并不能有效分离出DOM的“亚单位”结构，但是能揭示不同分子量的物质组成和化学性质。

图5 典型BC DOM分子量组分的EEM光谱

通过FRI(荧光区域体积积分)进一步定量解析了不同类型DOM的组成特征[13]。通过计算发现，稻秆和猪粪BC DOM及其分子量组分中的A，C，S，T，D和B区域积分体积分别占总和的43%～54%，22%～35%，10%～17%，5%～10%，1%～4%和1%～2%。结果说明类腐殖质(A和C)是BC DOM主要的物质组成，而类蛋白质中仅低激发色氨酸类(S)含量相对较高。该结果同前期报道的污泥、稻壳、木屑、湿地植物BC DOM的荧光物质以类腐殖质为主的组成特征一致[3, 14]。此外，该结果也显示不同类别BC DOM及其分子量组分的同一类型的荧光组分相对含量差异不大，表明DOM与其分子量组分具有相似的物质组成，再次证实BC DOM是一类连续的物质体系[15]。另一方面，不同类型稻秆BC DOM的荧光物质中>5 kDa组分的相对含量明显高于猪粪BC DOM，表明稻秆BC DOM具有更为复杂的大分子结构，与SUVA254反映结果一致。

结合图5和FRI定量解析结果可看出，富里酸类(A)、腐殖酸类(C)和低激发色氨酸类(S)是BC DOM的主要荧光物质。利用FRI进一步定量观测了BC DOM单一荧光组分中不同分子量组分所占百分比(图6)。由图6可看出，稻秆和猪粪BC DOM的荧光物质(A，C和S)中>5，1～5和<1 kDa组分所占百分比分别为59%～70%和22%～28%，14%～30%和24%～40%，7%～31%和37%～48%。由此可知，稻秆BC DOM的各分子量级组分均以类富里酸组成为主，而猪粪BC DOM的各分子量级组分主要以低激发色氨酸荧光物质组成为主。另一方面，裂解温度对于BC DOM分子量组分中荧光物质组成有重要影响。随着裂解温度的升高，稻秆BC DOM中>5和1～5 kDa的富里酸类和腐殖酸类组分均呈现一定的增长趋势，而<1 kDa的低激发色氨酸类组分却显著降低。相比而言，猪粪BC DOM中>5和<1 kDa的富里酸类和低激发色氨酸类物质含量随裂解温度的升高均呈现降低的趋势，而1～5 kDa的腐殖质类物质含量却不断增加。结果表明，BC DOM中1～5 kDa的荧光物质组分的稳定性相对较强，而<1 kDa的荧光物质组分稳定性最弱。

图6 不同BC DOM中荧光物质的分子量分布特征

2.3.2 FI, BIX和HIX

表1显示不同类型BC DOM的分子量级组分的荧光特征参数(FI，BIX和HIX)。FI，BIX和HIX可有效指示DOM的芳香度及腐殖化程度[8, 14]。一般，FI<1.4或BIX<0.6或HIX>10时，表明DOM芳香度和腐殖化程度高；当FI>1.7或BIX>1或HIX<4时，表明DOM芳香度和腐殖化程度较低[2, 12]。由表1可知，不同类型BC DOM及其分子量组分的FI，BIX和HIX值分别在1.71～3.67，0.63～1.57和2.52～12.50，表明BC DOM主要以较低芳香度和较低腐殖化程度的有机质组成。除P500以外，稻秆BC DOM及其分子量组分比猪粪BC具有更低的FI和BIX值和更高的HIX值，表明低裂解温度下制备稻秆BC释放出的DOM比猪粪BC具有较高的芳香度和腐殖化程度。另一方面，不同类型BC DOM中分子量组分的荧光特征参数呈现出一定的分布趋势。其中，FI和BIX基本呈现为低分子量(<1 kDa)>中分子量(1～5 kDa)>高分子量(>5 kDa)分布趋势，而HIX值呈现出明显的低分子量(<1 kDa)<中分子量(1～5 kDa)<高分子量(>5 kDa)分布趋势。这些结果再次证实高分子量组分富集了较多的具有高芳香性和高腐殖化程度的有机组分，其化学结构较为复杂。

表1 BC DOM分子量级组分的FI，BIX和HIX

3 结 论

(1)利用超滤将BC DOM分离为<1，1～5和>5 kDa组分。以DOC计，300～500 ℃裂解温度下稻秆和猪粪BC DOM在<1，1～5和>5 kDa组分中的分布分别为42%～60%，16%～23%和23%～29%；以α254计，分布范围分别为4%～27%，8%～49%和26%～81%。结果表明BC DOM的DOC主要分布在<1 kDa组分，而发色物质主要分布在>5 kDa组分。

(2)E2/E3和SUVA254能有效指示BC DOM的分子量组分的分布规律。400和500 ℃下BC DOM中>5和1～5 kDa组分的分子量和芳香度要明显高于300 ℃。稻秆BC DOM中>5 kDa组分比猪粪BC DOM中>5 kDa组分具有更多的芳香族结构，而猪粪BC DOM中<1 kDa组分的芳香度却高于稻秆。

(3)EEM结果显示BC DOM中各级分子量组分具有相似的光谱特征，表明BC DOM是一种连续体系。就荧光物质组成而言，稻秆BC DOM的分子量级组分均以类富里酸组成为主，而猪粪BC DOM的分子量级组分则以低激发色氨酸荧光物质组成为主。荧光参数对比结果显示BC DOM中<1，1～5和>5 kDa组分的FI和BIX基本呈现依次降低趋势，而HIX值则呈现出依次升高的趋势，结果表明BC DOM中高分子量组分富集了较多的具有高芳香性和高腐殖化程度的有机组分。