差异超速离心法对不同种属间充质干细胞外泌体分离的可靠性研究

赵仁礼，赖国华，吴家昌，吴铭杰，庄伟达，欧阳钧，桑宏勋

1.南方医科大学深圳医院骨科，深圳 518100；2.南方医科大学第三临床医学院，广州 510630 3.南方医科大学基础医学院人体解剖学教研室 广东省医学生物力学重点实验室，广州 510515

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种具有多向分化、组织修复、调节炎症和免疫应答以及神经保护等多种生物学功能的细胞[1]。研究表明，BMSCs 可通过不同的机制发挥自身功能[2]。除了传统的细胞间相互接触[3]，分泌细胞因子[4]或者通过配体-受体相互作用发挥免疫调节功能[5]以外，BMSCs亦可通过旁分泌有生物活性的外泌体（exosomes）的方式发挥相关病理生理学功能[6]。外泌体是直径在40～150 nm 之间的微囊泡，能够通过运输细胞内活性分子来介导细胞间通讯[7]。与其他细胞间信号传递方式相比，外泌体具有传输距离长，较稳定等特点，同时作为BMSCs 发挥功能的一种新途径，在相关研究领域拥有广泛的应用前景[8]。在目前的研究中，大鼠和小鼠作为最常使用的动物研究模型，其BMSCs 的外泌体也在组织修复和免疫调节方面受到了广泛关注[9]。而如何分离获取高纯度和高质量的BMSCs 来源的外泌体成为后续研究的基础和前提。本研究从小鼠及大鼠长骨骨髓中分离培养BMSCs，并通过同种差异超速离心的方法分离细胞培养上清中的外泌体，旨在探究差异超速离心法对BMSCs 来源外泌体分离的可靠性和稳定性，为进一步研究BMSCs 外泌体的生物学功能及其临床转化应用提供一种可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4～6 周清洁级C57 小鼠20 只，体重14～16 g，4～6 周清洁级SD 大鼠20 只，体重180～200 g，由南方医科大学实验动物管理中心提供，动物使用许可证号SYXK(粤）2016-0167。

1.1.2 主要试剂及仪器 α-MEM 培养基、南美胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液、胰蛋白酶-EDTA、PBS溶液和β 液巯基乙醇均购自美国Gibco 公司；谷氨酰胺溶液购自美国Corning 公司；小鼠及大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化试剂盒均购自赛业生物。大鼠及小鼠流式抗体PE-CD29、PECD44、PE-CD90、PE-Sca-1、PE-CD11b、PE-CD45、PECD19 及染色缓冲液均购自美国Biolegend 公司。BCA 试剂盒购自弗德生物，Western Blot 一抗CD9、CD63、CD81 和TSG101 均购自美国Abcam 公司，HRP二抗购自弗德生物。ECL 增强型发光液购自达科为公司。实验涉及仪器包括：莱卡正置荧光显微镜（DM4B），Fortessa 流式细胞仪（BD Biosciences）美国Beckman 公司超速离心机（Optima XPN-100），透射电镜（日本日立公司H7650）；纳米颗粒跟踪分析仪（英国马尔文公司，NanoSight NS3000）；化学发光仪（Bio-Rad）

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠及小鼠BMSCs 的分离和培养 颈椎脱臼处死老鼠，收集股骨和胫骨骨髓细胞，用完全培养基（α-MEM 培养基、15% FBS、1%双抗、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巯基乙醇）将细胞接种于培养皿中，48 h 后第一次换液，以后每隔2 d 换1 次完全培养基，至细胞生长融合至90%时，按照1:2 的比例进行传代。

1.2.2 BMSCs 成骨分化及茜素红染色 按照BMSCs成骨诱导分化培养试剂盒说明书进行诱导培养，具体步骤如下：取培养第3～5 代小鼠BMSCs，当细胞融合度达到60%～70%时，加入2 mL 成骨诱导分化完全培养基，每隔3 d 更换新鲜诱导分LL 化培养基，诱导4周,用茜素红染液对钙结节进行染色，用显微镜观察成骨染色效果。

1.2.3 BMSCs 成脂肪分化及油红O 染色 按照BMSCs 成脂诱导分化培养试剂盒说明书进行诱导培养，具体步骤如下：取培养第3～5 代BMSCs，待细胞融合度达到100 %后加入成脂诱导分化培养基A 液诱导3 d，然后加入成脂诱导分化培养基B 液诱导24 h，A 液和B 液交替诱导5 次后（20 d），继续用B 液维持培养5 d 直至脂滴变大变圆。加入油红O 染料工作液对脂滴进行染色，用显微镜观察成脂染色效果。

1.2.4 BMSCs 成软骨分化及阿利新蓝染色 按照BMSCs 成软骨导分化培养试剂盒说明书进行诱导培养，具体步骤如下：取培养第3～5 代小鼠BMSCs（5×106）转移到15 mL 离心管中，细胞离心后加入成软骨完全诱导培养基进行培养，每隔3 d 更换新鲜培养基，诱导28 d 后，加入阿利辛蓝染液，用显微镜观察染色效果。

1.2.5 BMSCs 流式细胞术检测 取培养第3～5 代BMSCs，消化后用染色缓冲液将细胞浓度调整至107个/ml，取100 μL 细胞悬液转移至1.5 mL EP 管中，在每个的EP 管中分别加入如下抗体：小鼠BMSCs:PECD29、PE-CD44、PE-Sca-1、PE-CD11b、PE-CD45、PECD19；大鼠BMSCs：PE-CD29、PE-CD90、PE-CD11b、PE-CD45 混匀后冰上避光孵育45 min，孵育完毕后，用4 ℃PBS 洗涤细胞250 g 离心5 min，重复一遍洗涤离心过程，用400 μL PBS 重悬细胞，将染色后的细胞样品上机检测。

1.2.6 BMSCs 外泌体的分离和纯化 取培养第3～5代BMSCs 消化后进行1:2 传代，传代后用去外泌体血清（纯血清100000 g 离心过夜，弃去沉淀，收集上清）配制的完全培养基培养48 h 后收集细胞上清，利用差速离心的方法分离纯化细胞上清中的外泌体，具体步骤如下（图1）：将收集的上清300 g 离心5 min，收集上清弃去沉淀；将上清2000 g 离心10 min，收集上清弃去沉淀；接着将上清10 000 g 离心1 h，收集上清弃去沉淀；将收集的上清放入超速离心机，110 000 g 离心70 min，小心弃去上清，用无菌PBS 重悬离心管底部沉淀，将重悬液再次110 000 g 离心70 min，小心弃去上清，离心管底部得到的沉淀即为分离纯化后的BMSCs 外泌体，用适量PBS 重悬底部外泌体，-80 ℃储存，待后续检测使用。

1.2.7 BMSCs 外泌体的形态学观察及NTA 粒径分析 取适量分离纯化后的外泌体样品，用1%戊二醛室温固定5 min，取10 μL 滴加至碳覆膜铜网上，滴加时形成水滴样，样品吸附90 s，用滤纸吸去多余液体后晾干，每个铜网上滴加10 μL 醋酸铀染色液，避光染色30 s，用滤纸吸去多余液体，晾干，于透射电镜（TEM）下观察外泌体样品形态；取适量浓度外泌体样品运用纳米颗粒示踪技术（NTA）对其粒径进行分析。

1.2.8 Western Blot 检测BMSCs 外泌体蛋白标志物表达水平 配制10%分离胶和5%浓缩胶，300 V 恒压30 min 分离蛋白样品，接着400 mA 恒流30 min 将样品转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，分别加入CD9、CD63、CD81 和TSG101 抗体4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次后加入对应种属的HRP 二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 试剂盒显影后进行扫描成像。

2 结果

2.1 小鼠和大鼠BMSCs 的培养和鉴定

从小鼠和大鼠的股骨和胫骨骨髓细胞中分离培养原代BMSCs，细胞均匀生长，原代细胞培养至10 d后即可进行传代，待细胞培养至3～5 代时，显微镜下观察细胞形态，可见细胞形态均一呈梭形（图2 A、E），形态清楚。取两种BMSCs 细胞分别进行成骨、成脂、成软骨诱导分化，诱导28 d 后，分别对诱导细胞进行茜素红、油红O、阿利新蓝染色。显微镜下观察到成骨诱导培养后的BMSCs 经茜素红染色，培养皿底可见典型红色矿化结节（图2 B、F）；成脂诱导后的BMSCs 经油红O 染色，细胞内可见圆形红色脂滴（图2 C、G）；BMSCs 成软骨诱导后，石蜡切片经阿利新蓝染色可见软骨组织中的内酸性粘多糖被染成蓝色（图2 D、H）。流式细胞术检测结果显示，小鼠BMSCs 表达CD29、CD44 和Sca-1 与细胞干性相关表面分子，不表达CD11b、CD45 和CD19 与造血或免疫细胞相关表面分子（图2I）。大鼠BMSCs 的流式结果显示CD29、CD90 高表达，CD11b 和CD45 基本不表达（图2J）。综上所述，分离培养的大鼠及小鼠BMSCs 具备干细胞特有的多向分化潜能，同时表达干细胞标志性表面抗原。

2.2 BMSCs 外泌体的分离和鉴定

通过差异超速离心法（图1），从细胞培养上清中分离纯化出BMSCs 来源的外泌体，并根据相关文献报道的检测方法从不同维度对收集的外泌体样品进行检测。透射电镜是鉴定外泌体形态的金标准，电镜下可观察到，无论是大鼠或小鼠，通过差异超速离心法分离纯化的外泌体均呈现典型的双层膜的杯托结构（图3A、B）。Western Blot 结果显示，与对应的BMSCs 细胞蛋白想比，大鼠和小鼠来源外泌体都能富集表达表面特异性标志蛋白CD63、CD9、CD81 以及外泌体体内蛋白TSG101（图3C），结果与文献报道的外泌体生物学特性相符。此外，通过纳米颗粒跟踪分析仪可检测出外泌体样品的直径分布范围，结果可见分离纯化后的两种外泌体直径多分布在50～150 nm 之间，且分布只有一个峰值(图3D、E)，提示外泌体粒径大小分布集中，且粒径符合相关文献报道。综上所述，通过差异超速离心法分离纯化的大鼠及小鼠外泌体都有典型的形态学特征且两者之间并没有形态学上的差异；同时，两种外泌体的粒径大小和特异性标志蛋白的表达情况都与文献报道相同，且两者并无差异。

3 讨论

外泌体是一种由晚期核内体膜向内凹陷而形成的囊泡结构[7]，是细胞间信号传递的重要载体，其自身包含多种蛋白质、RNA 等有生物学活性的物质，可将体内物质转运至特定受体细胞体，从而实现远距离细胞间信号传递，在免疫应答[10]、炎症反应[11]以及肿瘤转移[12]等许多病理生理学过程中发挥重要作用。同时，外泌体所发挥的生理或病理功能与其母细胞具有高度相似性。基于这个结论，BMSCs 来源的外泌体被认为是BMSCs 发挥功能的潜在介质。已有文献报道，BMSCs 来源的外泌体有促进成骨[13]，改善心肌缺血再灌注损伤[14]等作用。同时，外泌体相比于细胞而言具有易制备和储存,其功能不会随着时间的推移而减弱[1]等特点，在日后的临床应用和转化中相对于BMSCs 本身而言更具有优势。

目前，大规模分离和纯化细胞来源外泌体仍然存在一些问题，如何高效、高纯度地提取外泌体是外泌体研究方法学的基础。除了差异超速离心之外，基于不同的原理和外泌体不同的理化性质，例如：电荷中和沉淀、凝胶过滤、磁珠亲和和纯化等方法也逐渐被使用。但目前仍没有一种方法被外泌体研究领域认定为分离纯化的金标准。而就目前的研究来看，虽然差异超速离心法比较繁琐，耗时长，但因其易操作、高效经济、提取纯度高以及生物活性好等优点，目前仍然是从细胞培养上清中提取外泌体最常用的方法。

本研究从大鼠及小鼠骨髓细胞中培养原代BMSCs，对培养3～5 代BMSCs 进行多方向诱导分化并通过流式细胞术检测细胞表面标志物，鉴定分离培养BMSCs 细胞性质。接下来，通过差异超速离心的方法分离纯化两种BMSCs 来源的外泌体，并对所提取的外泌体进行了形态、粒径分析及蛋白标志物的检测。通过形态学和标志物的检测，分离出的外泌体与目前关于外泌体的定义以及相关文献报道相一致[7]。同时，两种外泌体在形态学和蛋白标志物表达方面并没有差异，仅仅通过外泌体的定性检测方法不能区分和确认两种外泌体。可能需要通过检测种属特异性蛋白才能更清楚地进行区分。

本研究旨在研究差异超速离心法对BMSCs 来源外泌体分离的可靠性。实验结果表明，无论是大鼠或小鼠来源的BMSCs，用差异超速离心法均能分离纯化到纯度较高，生物活性较好的外泌体。证明差异超速离心法是一种可靠的分离BMSCs 培养上清来源外泌体的方法。我们将继续探索并优化标准化的提取方法，为外泌体功能的相关研究奠定方法学基础。