基于网络药理学与数据挖掘分析中药调节DNA甲基化的用药规律

张艳 周庆兵 徐凤芹

摘要 目的：探究調节DNA甲基化的中药活性成分和用药规律。方法：运用GeneCards数据库获取DNA甲基化相关基因靶点，通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）查找靶基因相关的活性成分和中药，纳入条件为类药性≥0.18，口服生物利用度≥30%，构建中药-成分-甲基化靶点作用网络。采用DAVID 6.8数据库分析潜在靶点参与的生物过程及信号通路，同时收集中药功效及性味归经信息，分析调节DNA甲基化的用药规律。结果：获得23个潜在的DNA甲基化靶点，与449个活性成分和342味中药相匹配。其中山柰酚、槲皮素、木犀草素、黄芩素、异鼠李素等可能是干预DNA甲基化的主要活性成分，甘草、半枝莲、丹参、枸杞子、灯盏细辛等可能是干预DNA甲基化的主要中药。相关通路以TNF信号通路、Toll样信号通路等抗炎通路为主。用药规律分析显示，干预DNA甲基化的中药多性寒、味苦，归肝经，具有清热、止痛、补益等功效。结论：本研究系统探讨了中药调节DNA甲基化的活性成分，归纳了中药干预DNA甲基化的用药规律，以期为治疗DNA甲基化相关疾病的实验验证及新药研发提供思路。

关键词 DNA甲基化;表观遗传学;数据挖掘;用药规律;网络药理学;活性成分;中药;信号通路

Medication Rules of Chinese Medicines in Regulating DNA Methylation Based on Network Pharmacology and Data Mining

ZHANG Yan1，2，ZHOU Qingbing1，3，XU Fengqin1，3

（1 Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China; 2 Graduate School，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 Institute of Geriatrics，Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China）

AbstractObjective： To explore the active components and medication rules of Chinese medicines in regulating DNA methylation. Methods： GeneCards was used to search for the gene targets related to DNA methylation，and Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） to search for the active ingredients and herbal medicines related to the target genes.The inclusion conditions were drug-likeness≥0.18 and oral bioavailability≥30%，and the herbal medicine-component-target network was constructed.DAVID 6.8 was used to analyze the biological processes and signaling pathways involving the potential targets.At the same time，the efficacy，property，taste，and meridian tropism of the Chinese herbal medicines were collected to analyze the medication rules for regulating DNA methylation. Results： Twenty-three potential targets of DNA methylation were obtained，which were matched with 449 active components and 342 Chinese herbal medicines.Quercetin，kaempferol，luteolin，baicalin，and isorhamnetin may be the main active components for interfering with DNA methylation.Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Scutellariae Barbatae Herba，Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma，Lycii Fructus，and Erigerontis Herba may be the main Chinese herbal medicines for interfering with DNA methylation.The anti-inflammatory pathways such as TNF and Toll-like signaling pathway were mainly involved.The Chinese herbal medicines used for interfering with DNA methylation are cold and bitter，with tropism to the liver meridian and the main effects of clearing heat，relieving pain，and tonifying. Conclusion： This study predicted the active components of Chinese herbal medicines in regulating DNA methylation and summarized the medication rules for intervening with DNA methylation.It provides ideas for the experimental verification of treating DNA methylation-related diseases and the development of relevant drugs.13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

Keywords DNA methylation; Epigenetics; Data mining; Medication rule; Network pharmacology; The active ingredient; Traditional Chinese medicine（TCM）; Signaling pathways

中图分类号：R272;R249;R285 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.010

DNA甲基化（DNA Methylation）属于表观遗传学范畴，是指在DNA甲基转移酶DNMT3a，DNMT3b和DNMT1催化下，选择性地将甲基基团添加到CpG序列5-胞嘧啶，形成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程[1]。DNA甲基化可以调控下游基因表达，从而在生命活动中起着重要的作用，有学者认为调控DNA甲基化是干预疾病的新手段。尽管人体所有类型的细胞包含相同的DNA序列，但它们的甲基化模式是不同的。理解这个系统对理解如何建立稳定的细胞表型及其对正常生理、衰老和疾病的影响至关重要[2]。

目前调控DNA甲基化的西药仅在血液肿瘤疾病领域进入临床阶段，其余病种尚处于临床前阶段[3-5]。近年来，中药调控DNA甲基化的研究越来越多。据报道，中药复方及单体可通过调控DNA甲基化治疗血液、肿瘤、动脉粥样硬化等疾病[6-15]。未来需要对中医药干预异常基因甲基化进一步研究。

由于中药多成分、多靶点的特点，很难系统地寻找到干预DNA甲基化的中药及其用药规律。鉴于此，本研究从数据挖掘及网络药理学角度出发，构建DNA甲基化-靶点-活性成分-中药关系网络，挖掘用药规律，以期为未来中药调控DNA甲基化研究提供一定的思路及方向。

1资料与方法

1.1DNA甲基化靶点筛选及通路分析

通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）收集DNA甲基化相关靶点，检索词为“DNA methylation”。GeneCards数据库基本覆盖几大数据库对于基因的分析数据，是人类基因的综合数据库。应用DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对最终纳入研究的潜在靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析。

1.2活性成分筛选及靶点-活性成分网络构建

根据DNA甲基化靶點信息，通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）纳入与靶点相关且类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%的活性成分。

1.3DNA甲基化靶点-成分-中药网络构建

关联活性成分相关中药，构建DNA甲基化靶点-成分-中药网络，运用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。通过对网络节点度值（Degree）分析，识别网络中的关键节点，同时初步探讨中药和活性成分对DNA甲基化的干预强度。

1.4中药数据整理与归纳

以《中华人民共和国药典》2020版为标准，将中药名称规范，并对其性、味、归经及疗效进行统计分析。中药功效信息整理方法如下：以药典记录的功效为准则，按词频分解，如“清热解毒”分解为“清热”“解毒”，“凉血止血”分解为“凉血”“止血”，若中药功效不能分解，如“活血化瘀”“补益肝肾”等则整体分析，相似功效合并分析。

2结果

2.1DNA甲基化靶点筛选及通路分析

本研究共筛选到14 008个DNA甲基化靶点。将候选靶点置于TCMSP，以化合物OB≥30%、DL≥0.18为条件纳入化合物匹配的靶点，共计23个。见表1。

核心靶点涉及基因表达正调控（Positive regulation of gene expression）、序列特异性DNA结合转录因子活性的调控（Regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）等56项生物过程（Biological Process，BP）（ P <0.05）;酶结合位点（Enzyme binding）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合（RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity，ligand-activated sequence-specific DNA binding）等20项分子功能（Molecular Function，MF）（ P <0.05）;核浆（Nucleoplasm）、细胞外隙（Extracellular space）等10项细胞组分（Cell Component，CC）（ P <0.05）;仅展示每种类别前10项。见图1。 P <0.05的信号通路共有56条，主要包括：TNF信号通路、NOD样受体信号通路、FoxO信号通路、GnRH信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路等，前20条信号通路。见图2。13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

2.2活性成分筛选及靶点-活性成分网络构建

检索到449个调控DNA甲基化的相关化合物。靶点-活性成分网络由508个节点，11 440条边构成。Degree值排名前5%的化合物有槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、芒柄花黄素（Formononetin）等24个，上述活性成分与DNA甲基化相关靶点联系较多为重要成分。Degree值前5位的靶点为AR、PPARG、PGR、TNF、ICAM1，这些靶点与众多小分子物质相互作用，与DNA甲基化密切相关。见表2。

2.3DNA甲基化靶点-成分-中药网络构建

与DNA甲基化靶点相关的483种活性成分，追溯到相关中药399味。除去《中华人民共和国药典》未报道的中药58味（例如白药子、八角莲、大风子等），共获得中药334味。甲基化靶点-成分-中药网络共808个节点，14 760条边。DNA甲基化靶点与34味中药关联Degree值位于前10%，包括甘草182、半枝莲46、枸杞子43、丹参42、灯盏细辛42、银杏叶42、葫芦巴41、苦参40、淫羊藿40、山豆根37、蔓荆子37、降香37、菊花37、红花36、香附36、余甘子36、鸡血藤35、白果35、香薷35、金银花34、连翘34、延胡索34、黄芪34、沙苑子34、马鞭草33、沙棘33、紫菀33、麻黄32、没药31、半边莲30、青蒿30、桑叶30、旋覆花30和夏枯草30。构建了34味中药-成分-甲基化靶点网络，包括300个节点，4 137条边，其中红色倒三角表示DNA甲基化，桃红色菱形表示靶点，绿色六边形表示中药，粉色长方形表示活性成分，Degree值越大形状越大。见图3。

2.4中药性味-归经-功效结果统计

研究发现，寒性、苦味及归属肝经的药物对DNA甲基化调节作用最强，分别占比36.97%、35.84%、24.63%。归经前3位为肝经、肺经、脾经;性前3位依次为寒、温、热;味前3位为苦、辛、甘。就功效而言，共分解-归纳出中药功效20种，其中具有清热、解毒、补益功效位于前3位，占比分别为18.81%、10.96%、9.33%。Degree值位列前茅的药物与性味、归经及功效的用药规律相符。见图4。

3讨论

DNA甲基化易受环境、饮食等因素影响，改变 基因表达而不改变DNA序列[16]。因此，许多研究者将中医预防治疗原则与表观遗传学相结合，通过改善环境、情绪，甚至通过中药、针灸和饮食的干预，更好地预防疾病[17]。本研究发现槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花黄素、异鼠李素、薯蓣皂苷配基、鞣花酸、汉黄芩素、黄芩素、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯、β-胡萝卜素、花葵素、烟酸等与DNA甲基化靶點连接较多，被认为是干预DNA甲基化的主要活性成分。其中，儿茶素、槲皮素等多酚及天然黄酮类物质，具有抗炎、抗氧化作用，还可通过抑制DNMTs活性抑制甲基化[18]。（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯是最有效的人DNMT1抑制剂，通过没食子酸的部分特异性抑制该酶的催化活性[18]，其抗氧化活性与恢复抗氧化酶活性有关[19]。槲皮素通过对基因表达的影响发挥抗氧化、抗炎作用。研究发现，槲皮素降低了DNMT1的总活性和NF-E2相关因子2（Nrf2）基因启动子区DNA甲基化水平[20]。山柰酚诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常细胞起保护作用。山柰酚可能通过调控DNMTs和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACs）蛋白表达，从而降低结直肠癌抑制因子DACT2基因表达水平，抑制Wnt信号通路阻断肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制转移性肿瘤的迁移且抑制MMPs[21]。此外，山柰酚可通过核因子κB炎症信号通路减轻炎症反应，增强机体抗氧化能力。本研究未涉及的低频化合物如白藜芦醇也有调控DNA甲基化的作用[22]。高频活性成分多“药食同源”，保证了中药开发的安全性，也体现了食疗的可靠性[23]。核心通路MAPK方面，栀子、川芎显示对MAPK信号通路差异甲基化基因的双向调节作用[24]。

通过对靶点-成分-中药网络分析，发现甘草、半枝莲、枸杞子、丹参、灯盏细辛、银杏叶等中药所含靶点数目较多，因此推测它们对DNA甲基化有更大影响。对中药信息结果统计发现，肝、肺二经占影响DNA甲基化机制中药的44.36%，性味以寒、温，苦、辛、甘为主，苦寒之品多有清热解毒的功效，甘温之类多有扶正温补之效，此亦与中药功效分析结果相一致。根据上述结果推测治疗DNA甲基化相关疾病应注重清热活血解毒，扶正祛邪的作用。此外，中医学认为寒属阴，温属阳，阴阳的属性与低甲基化、高甲基化特性不谋而合[25-26]。此外，DNA甲基化个性化的特点与中医药辨证论治个体化特点相符，更凸显中医药调控DNA甲基化的研究前景。中医药阴阳理论、个性化、动态性的特点可以指导表观遗传学的发展。

综上所述，本研究基于网络药理学构建了DNA甲基化靶点-成分-中药网络，并系统阐述了三者间的关系。通过数据挖掘方法归纳与DNA甲基化相关的活性成分及中药的相关信息，以期为DNA甲基化相关疾病的治疗和新药研发提供线索。本研究也存在一定局限性，仅从药物-靶点-疾病相关性入手，并未考虑量-效关系，后期需要基础实验及临床试验的验证[27]。此外，甲基化与中药的机制研究需要遗传学、社会学、心理学等多学科的支持和交叉。

所有作者间不存在利益冲突。

参考文献

[1] Jaenisch R，Bird A.Epigenetic regulation of gene expression：how the genome integrates intrinsic and environmental signals[J].Nat Genet，2003，33 Suppl：245-254.

[2]Dor Y，Cedar H.Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J].Lancet，2018，392（10149）：777-786.13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

[3]Nicorescu I，Dallinga GM，de Winther M，et al.Potential epigenetic therapeutics for atherosclerosis treatment[J].Atherosclerosis，2019，281：189-197.

[4]Mack GS.To selectivity and beyond[J].Nat Biotechnol，2010，28（12）：1259-1266.

[5]Christman JK.5-Azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation：mechanistic studies and their implications for cancer therapy[J].Oncogene，2002，21（35）：5483-5495.

[6]Chen Q，Zhang Y，Meng Q，et al.Liuwei Dihuang prevents postmenopausal atherosclerosis and endothelial cell apoptosis via inhibiting DNMT1-medicated ERα methylation[J].J Ethnopharmacol，2020，252：112531.

[7]Zhou QB，Yang XH，Wang HZ，et al.Effect of Qinghuang Powder Combined with Bupi Yishen Decoction in Treating Patients with Refractory Cytopenia with Multilineage Dysplasia through Regulating DNA Methylation[J].Chin J Integr Med，2019，25（5）：354-359.

[8]Zhang SF，Mao XJ，Jiang WM，et al.Qian Yang Yu Yin Granule protects against hypertension-induced renal injury by epigenetic mechanism linked to Nicotinamide N-Methyltransferase（NNMT） expression[J].J Ethnopharmacol，2020，255：112738.

[9]Cheng YL，Zhang XH，Sun YW，et al.Genomewide DNA Methylation Responses in Patients with β-Thalassemia Treated with Yisui Shengxue Granules[J].Chin J Integr Med，2019，25（7）：490-496.

[10] 周雪雷.參芪复方作用KKAy小鼠糖尿病大血管病变量效时关系研究及表观遗传学机制探索[D].成都：成都中医药大学，2014.

[11]陈惠.基于表观遗传改变和Notch通路的养肺活血方抗肺成纤维细胞表型转化研究[D].南京：南京中医药大学，2018.

[12]贾镭.可可影响血脂谱的荟萃分析及FOXP3基因甲基化修饰与动脉粥样硬化的相关性研究[D].北京：北京协和医学院，2011.

[13]左谦.祛瘀解毒方治疗晚期转移性大肠癌疗效及其转录组学机制探讨[D].广州：广州中医药大学，2019.

[14]周明学，李思耐，刘卫红，等.丹红注射液对动脉粥样硬化小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化及PI3K/Akt/mTORC1信号通路的影响[J].中国中医药信息杂志，2019，26（8）：46-50.

[15]Lai X，Zhang Y，Li M，et al.The Effect of Shen-Yuan-Dan Capsule on Autophagy-Related Gene Atg13 Promoter Methylation and Genomic Methylation Levels in Atherosclerotic Mice[J].Acta Cardiol Sin，2020，36（3）：260-267.

[16]Zhong J，Agha G，Baccarelli AA.The Role of DNA Methylation in Cardiovascular Risk and Disease：Methodological Aspects，Study Design，and Data Analysis for Epidemiological Studies[J].Circ Res，2016，118（1）：119-131.

[17]Keating ST，El-Osta A.Epigenetics and metabolism[J].Circ Res，2015，116（4）：715-736.

[18]Lee WJ，Shim JY，Zhu BT.Mechanisms for the inhibition of DNA methyltransferases by tea catechins and bioflavonoids[J].Mol Pharmacol，2005，68（4）：1018-1030.

[19]Pandey M，Shukla S，Gupta S.Promoter demethylation and chromatin remodeling by green tea polyphenols leads to re-expression of GSTP1 in human prostate cancer cells[J].Int J Cancer，2010，126（11）：2520-2533.13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881

[20] Liu CM，Ma JQ，Xie WR，et al.Quercetin protects mouse liver against nickel-induced DNA methylation and inflammation associated with the Nrf2/HO-1 and p38/STAT1/NF-κB pathway[J].Food Chem Toxicol，2015，82：19-26.

[21]欧日兰.山柰酚化学预防结直肠癌作用及机制[D].广州：广州中医药大学，2016.

[22]Aldawsari FS，Aguayo-Ortiz R，Kapilashrami K，et al.Resveratrol-salicylate derivatives as selective DNMT3 inhibitors and anticancer agents[J].J Enzyme Inhib Med Chem，2016，31（5）：695-703.

[23]Chistiakov DA，Orekhov AN，Bobryshev YV.Treatment of cardiovascular pathology with epigenetically active agents：Focus on natural and synthetic inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation[J].Int J Cardiol，2017，227：66-82.

[24]Zhou QB，Wu LQ，Zhang Y，et al.Effects of Zhizi Chuanxiong Capsule（栀子川芎胶囊） on Abnormal Methylation in Rabbits with Atherosclerosis[J].Chin J Integr Med，2018，24（7）：512-517.

[25]罗可可，欧晓华，邓文静，等.5-氮杂胞苷对醇型广藿香DNA甲基化及指标性成分的影响[J].中国中药杂志，2021，46（16）：4117-4123.

[26]Hu XQ，Su SB.An overview of epigenetics in Chinese medicine researches[J].Chin J Integr Med，2017，23（9）：714-720.

[27]世界中医药学会联合会.网络药理学评价方法指南[J].世界中医药，2021，16（4）：527-532.

（2021-04-07收稿本文編辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973679）;国家重点研发计划“中医药现代化研究”专项（2017YFC1700301）;中医药传承与创新“百千万”人才（岐黄工程）岐黄学者作者简介：张艳（1991.09—），女，博士研究生在读，研究方向：中医药防治心血管病，E-mail：zhangyan8120@163.com通信作者：徐凤芹（1962.05—），女，博士，教授，主任医师，研究方向：中医药防治心血管病，E-mail：Dr.xufengqin@outlook.com13394B73-CB2C-4322-A0A1-5D8D25E41881