康莱特注射液对淋巴瘤Raji细胞的杀伤作用

李丹 赵百孝 王建勋 韩丽 胡凯文

摘要 目的：研究不同浓度康莱特注射液（KLT）对人伯基特淋巴瘤Raji细胞株的增殖抑制与凋亡作用，探讨其防治恶性肿瘤的作用机制。方法：应用流式细胞术、CCK-8法等方法观察12、24、48 h不同时间点KLT对Raji细胞生长的影响。结果：流式细胞术检测发现，KLT浓度为1、10、50、100、200 μL/mL作用12 h可引起Raji细胞凋亡率-0.95%、50.93%、100%、44.39%、-9.94%;CCK-8检测发现，KLT浓度为1、10、50 μL/mL作用12 h可引起Raji细胞生长抑制率为55.41%、25.15%、39.94%，100、200 μL/mL可促进细胞增殖率为122.62%、146.81%;KLT作用24 h后可引起Raji细胞生长抑制率为32.25%、26.24%、31.61%、129.49%、160.09%;KLT作用48 h后可引起Raji细胞生长抑制率为91.65%、81.47%、33.74%、103.75%、50.97%。结论：KLT对Raji细胞株的生长具有促进、抑制双向调节作用，并与作用时间及浓度密切相关。

关键词 康莱特注射液;Raji细胞;凋亡;流式细胞术;CCK-8法

Killing Effect of Kanglaite Injection on Lymphoma Raji Cells

LI Dan1，ZHAO Baixiao2，WANG Jianxun3，HAN Li2，HU Kaiwen4

（1 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 3 School of Life Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 4 Department of Oncology，Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

AbstractObjective： To study the effects of different concentrations of Kanglaite Injection（KLT） on the proliferation and apoptosis of human Burkitt′s lymphoma Raji cells，and to explore the mechanism of KLT in preventing and treating malignant tumors. Methods： Flow cytometry and CCK-8 assay were employed to study the effects of KLT on the growth of Raji cells at the time points of 12，24，and 48 h. Results： The results of flow cytometry showed that the exposure to 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT for 12 h caused the apoptosis rates of -0.95%，50.93%，100%，44.39%，and -9.94%，respectively，in Raji cells.The CCK-8 assay demonstrated that 1，10，and 50 μL/mL KLT treatments for 12 h showed the inhibition rates of 55.41%，25.15%，and 39.94%，respectively，on Raji cells，while 100 μL/mL and 200 μL/mL KLT led to the cell proliferation rates of 122.62% and 146.81%，respectively.The 1，10，50，100，and 200 μL/mL KLT treatments for 24 h led to the inhibition rates of 32.25%，26.24%，31.61%，129.49%，and 160.09%，respectively.The treatments for 48 h caused the inhibition rates of 91.65%，81.47%，33.74%，103.75%，and 50.97%，respectively. Conclusion： KLT has dual regulatory effects on the growth of Raji cells，which is associated with the treatment time and KLT concentration.

Keywords Kanglaite Injection; Raji cells; Apoptosis，Flow cytometry; CCK-8

中圖分类号：R248;R285.5 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.016843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin Lymphoma，NHL）是全球最常见的血液系统恶性肿瘤，占癌症诊断和死亡总人数近3%，男性患病風险高于女性，其发病率近年来逐渐提高[1-2]。化学治疗是NHL的主要方法，引起的不良反应可增加患者生理和心理负担，进而产生强烈应激反应，导致患者出现负性情绪，影响化疗依从性[3]。其中医病因病机涉及湿、痰、毒、瘀、虚，利湿、化痰、解毒、化瘀、扶正是淋巴瘤的重要治法。当代肿瘤名家王沛、黄振翘等总结历代先贤相关论述并结合临床实践，将NHL归为7大类证候：气滞毒瘀型、寒痰凝滞型、虚火痰结型、血瘀痰积型、血热风燥型、肝肾阴虚型、气血两亏型[4-5]。薏苡仁，其味甘，性微寒，归脾、胃、肺经;《神农本草经》云：“主筋急，拘挛不可屈伸，风湿痹，下气……”现代药理研究证实，其中含有酯类、脂肪酸、多糖、甾体、三萜及蛋白质等化合物逾41种，具有调节机体免疫、降低血糖浓度及抑制肿瘤生长等作用[6]，是抗癌中药康莱特注射液（KLT）的主要成分，临床上并被广泛应用于肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌等实体瘤及白血病、淋巴瘤等血液肿瘤的治疗[7]。

本研究通过流式细胞仪观察不同浓度KLT干预Raji细胞12 h后的肿瘤细胞凋亡率;CCK-8法观察12 h、24 h、48 h时KLT对Raji细胞生长情况的影响，立足于为临床提供KLT治疗NHL最适剂量的实验室依据，并进一步丰富KLT治疗NHL学术内涵。

1材料与方法

1.1细胞

血液瘤Raji细胞株（中国医学科学院基础医学研究所，货号：3101HUMTCHu44）。

1.2药物与试剂

康莱特注射液（浙江康莱特药业有限公司，国药准字Z10970091）执行标准：WS3-301（Z-038）-2001（Z），均在常温干燥处保存。RPMI1640培养基（Gibco，批号：1517016），FBS（Biological Industries，批号：1715752），青-链霉素（Caisson Labs，批号：PSL01），CCK-8（北京北仁化学，批号：20150221）。

1.3主要仪器

离心机（Eppendorf，德国，型号：5417R），超净工作台（哈尔滨市东联，型号：FLC-3），倒置显微镜（OLYMPUS，日本，型号：CKX41），二氧化碳培养箱（SANYO，日本，型号：MC0175），流式细胞仪（江苏贝克曼库尔特，型号：A00-1-1102），荧光/吸收光酶标仪（BioTek，美国，型号：ELx800）。

1.4实验方法

1.4.1Raji细胞培养

Raji细胞（购买于中国医学科学院基础医学研究所）以1×106个/mL接种于含新鲜的RPMI1640培养液（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素及10%胎牛血清）中培养于37 ℃、5%CO2的培养箱内，待细胞系处于对数生长期加入不同浓度KLT进行加药处理。

1.4.2细胞形态观察及流式细胞仪测定

以1、10、50、100、200 μL/mL的KLT处理5×105个处于对数生长期的Raji细胞12 h，倒置显微镜观察细胞状态，用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS）清洗细胞，用45 μL染色缓冲液重悬细胞，每孔加入相应荧光标记抗体5 μL;4 ℃或者室温避光孵育30 min至1 h，可在摇床上慢摇加速染色，每孔加入PBS清洗，用40 μm滤网过滤细胞，进行流式检测。数据经CellQuest软件进行分析（Becton Dickinson，San Jose，CA，美国）。

1.4.3实验分组及CCK-8法观察各组细胞生长情况

实验分为空白对照组和1、10、50、100、200 μL/mL不同浓度梯度KLT观察组。收集对数生长期Raji细胞，设置各浓度细胞培养基及调整细胞悬液浓度至2×105个/mL，每孔100 μL接种于96孔板，各设5个复孔，边缘孔用0.01 mol/L无菌PBS填充，于37 ℃，5%CO2培养箱里分别培养12 h、24 h、48 h后，在避光条件下统一加入含10%CCK-8无血清培养基100 μL，37 ℃，5%CO2条件下继续培养2 h，于酶标仪450 nm波长处检测并记录光密度（Optical Density，OD）值，计算各观察组增殖率。

增殖率（%）=（给药组-空白组）OD值/空白组OD值×100%。

1.5统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，满足正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准差（  ±s ）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1KLT对Raji细胞凋亡的影响

位于左下象限（Annexin V-PI-）提示为活细胞，分布于左上象限（Annexin V-PI+）的为损死或坏伤的细胞，位于右下象限（Annexin V+PI-）的细胞提示有早期凋亡，分布于位于右上象限（Annexin V+PI+）则为晚期凋亡的细胞。

12 h后1、10和50、100、200 μL/mL与空白对照组KLT处理后的Raji细胞早期凋亡率分别为（8.67±2.00）%、（13.22±2.28）%、（17.51±1.20）%、（11.98±2.82）%、（7.89±2.50）%、（8.27±2.51）%。与空白对照组比较，10 μL Raji细胞的早期凋亡率增加（ P <0.05），50 μL Raji细胞的早期凋亡率明显上升（ P <0.01）。见图1～2。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

2.2KLT对Raji细胞增殖的影响

与空白对照组比较，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL组Raji细胞数量显著减少（均 P <0.01），100 μL、200 μL组的Raji细胞数量明显增加;12、24 h后，与50 μL组比较，空白对照组Raji细胞数量显著减少（均 P <0.01），100 μL、200 μL组Raji细胞数量明显增加（均 P <0.01）;48 h后，与50 μL组比较，1 μL、10 μL组与空白对照组Raji细胞数量显著减少（均 P <0.01），100 μL、200 μL组Raji细胞数量明显增加（均 P <0.01）。见表1。

2.3KLT对Raji细胞增殖率的影响

与空白对照组比较，12、24、48 h的1 μL、10 μL、50 μL组的Raji细胞增值率为负值，100 μL、200 μL组的Raji细胞增殖率为正值，康莱特在1 μL、10 μL、50 μL浓度内对Raji细胞具有抑制作用，100 μL、200 μL浓度对Raji细胞增殖具有促进作用，其中，1 μL组的抑制作用与100 μL组的促进作用最显著。见表2。

3讨论

前期研究表明，KLT联合化疗药物治疗肿瘤，具有显著“增效减毒”效应。姚小健[8]将49例老年胃癌随机分为2组，对照组22例接受替吉奥联合奥沙利铂化疗，观察组27例在对照组的基础上给予KLT，结果对照组有效率为36.4%，疾病控制率为45.5%，远低于观察组的66.7%、77.8%，差异有统计学意义（ P <0.05）。2组主要不良反应均为Ⅰ、Ⅱ度的胃肠道反应、肝功能损伤、肾功能损伤、神经毒性及骨髓抑制，发生率比较差异无统计学意义（ P >0.05）。对照组生命质量改善率为36.4%，体质量改善率27.3%，远低于观察组的66.7%、59.3%，且差异有统计学意义（均 P <0.05）。对于肺部恶性肿瘤转移脑部患者，谭宝利[9]在旋转式伽马刀及立体定向全脑放疗联合KLT治疗中，单纯放疗组的无进展生存期（Progression Free Survival，PFS）为10.9个月，而联合组的PFS为11.9个月。KLT能减轻晚期鼻咽癌患者放疗的不良反应，提高患者的生命质量。张苗苗[10]收集明确临床诊断为转移或进展期为Ⅲ、Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，随机分为对照组和观察组，每组50例。观察组接受KLT联合吉西他滨及顺铂化疗治疗，对照组接受吉西他滨及顺铂化疗治疗，结果观察组的联合治疗提高了化疗疗效，并增加了化疗患者对疾病的抵抗力，延长了癌症患者的寿命。杨晓玲[11]对41例晚期恶性肿瘤患者应用KLT治疗前后的研究发现，KLT治疗后患者体力状况、进食量及体质量均较治疗前明显改善;血清白蛋白、前清蛋白及血红蛋白等指标较前升高（均 P <0.05）;T细胞亚群CD3、CD4及自然杀伤细胞比例较治疗前提高，差异有统计学意义。

魏卫等[12]在相关研究中补充了KLT可以显著改善肿瘤患者胃肠道功能，正如《本草经疏》所云“性燥能除湿，味甘能入脾补脾……利肠胃，消水肿令人能食”。谢和平等[13]将64例中晚期原发性肝癌患者随机分为观察组和对照组。对照组单纯接受TACE治疗，观察组在TACE治疗的基础上联合使用KLT。结果治疗后，对照组的改善程度及上升例数，卡诺夫斯凯计分评分数值方面均差于观察组（均 P <0.05）。观察组完全缓解1例，部分缓解15例，总有效率50.0%;对照组完全缓解0例，部分缓解8例，总有效率25.0%，观察组总有效率显著优于对照组（ P <0.05）。黄挺等[14]为了观察KLT与肝动脉结扎法对大鼠荷瘤脾重与肝癌转移灶的抑制作用，通过接种W256癌肉瘤建立Wistar大鼠肝癌转移模型，发现KLT可显著抑制原发灶生长与肝癌转移灶形成，抑制基质金属蛋白酶-1表达是其抗肝转移的重要机制。实体肿瘤生长、浸润和转移必须有肿瘤血管形成，其中，血管内皮生长因子（VEGF）作为血管形成因子起重大的作用。 莫安薇等[15]收集非小细胞肺癌（NSCLC）伴发恶性胸腔积液患者108例作为研究对象，随机分为对照组和观察组，每组54例。对照组胸腔注射注射用洛铂，30 mg/m2溶于5%葡萄糖注射液50 mL。观察组在对照组基础上胸腔注射KLT，100 mL/次，1次/d。治疗后发现，2组患者胸水中VEGF和RCAS1（Receptor-binding Cancer Antigen Expressed on SiSo Cells， 一种表达于SiSo细胞受体结合肿瘤抗原）表达均显著减低（均 P <0.01），且观察组胸水中VEGF和RCAS1表达显著低于对照组（均 P <0.05）。

前期研究证实，中医药联合化疗等治疗方式可很大程度改善NHL患者的预后。王孟琦等[16]对336例随访期NHL患者的中医证型分布、中医症状特点及证型与临床检验指标的相关性进行了研究，发现预后可能较好的是脾虚湿盛证的患者，而痰瘀互结证、阴虚证、痰湿凝滞证及痰热内蕴证的患者，其预后可能相对较差。刘凯等[17]将符合纳入标准的31例NHL患者随机分为观察组15例和对照组16例。对照组采用CHOP方案化疗，观察组在对照组的基础上联合六味地黄丸治疗，观察比较2组疗效。2组总有效率差异无统计学意义（ P >0.05），但Ⅱ/Ⅲ度胃肠道反应发生率观察组为31.2%，低于对照组的46.7%（ P <0.05）;骨髓抑制发生率观察组低于對照组（ P <0.05）; 对照组肝肾毒性发生率为26.7%，观察组为12.5%，对照组明显高于观察组（ P <0.05）;治观察组患者在潮热盗汗、腰膝酸软、消瘦等改善明显优于对照组（ P <0.05）。陈四明等[18]选取阴虚火旺型NHL患者58例，将其随机分为观察组和对照组，每组29例。对照组接受CHOP化疗方案治疗，观察组在对照组的治疗方案上给予穴位敷贴联合牛角地黄汤治疗，试验结果提示观察组能够显著减少阴虚火旺型NHL患者化疗后的不良反应发生，并提高实体瘤的临床疗效。陈方等[19]将B细胞NHL患者随机分为30例对照组及32例观察组，对照组给予单纯化疗治疗，观察组联合扶正散结汤，观察2组患者治疗结束后的治疗效果、不良反应及PFS。发现扶正散结汤联合化疗治疗B细胞NHL可明显减轻化疗不良反应及延长患者PFS。843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F

另外，除实体瘤外，KLT还被广泛应用于白血病、淋巴瘤等血液肿瘤的治疗中，但相关的机制研究还较少。前期研究中，董庆华等[20]观察KLT对耐药人白血病细胞K562/adr及K562/vcr的作用研究中，发现KLT能逆转多药耐药人白血病细胞株的耐药性，并能诱导其凋亡。有研究应用细胞生长曲线、电镜及流式细胞仪等观察了KLT对Raji细胞生长情况的影响，发现小剂量KLT即可使Raji细胞凋亡[21-22]。本研究中获取的实验结果示，KLT中小剂量对Raji细胞的抑制效果最佳，剂量过高并不能增加其对Raji细胞的杀伤作用，相反，高浓度KLT对Raji细胞的增殖具有促进作用。这一实验结果，也更好地揭示了中医药的双向调节作用，并为临床选取最优剂量提供了实验室依据。我们在实验过程中发现，KLT本身的浓度梯度会对OD值产生影响，二者正相关。该实验结果表明，KLT对Raji细胞株的生长具有促进、抑制的双向调节作用，并与作用时间及浓度密切相关。

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（2021-05-09收稿本文编辑：杨觉雄）

基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFC1711904）;教育部双一流引导专项师资队伍建设项目（1000061020014）作者简介：李丹（1991.08—），女，博士研究生在读，研究方向：中西医结合防治恶性肿瘤，E-mail：20190941214@bucm.edu.cn通信作者：胡凯文（1964.08—），男，博士，主任医师，教授，研究方向：中西医结合防治恶性肿瘤，E-mail：drkaiwenhu@163.com843486C5-B57B-4A4A-8DAF-3B43C8275F6F