液相色谱-核磁共振联用技术的发展与应用

郭凌霄，谢丰鸣，张倩倩

(山东万达化工有限公司，山东 东营 257500)

0 引言

核磁共振(NMR)是一种得到有机物详细结构的重要方法，但其所需的样品要为纯净物，当有杂质存在时会严重影响其对结构的分析，所以对混合样品需要一个强大的手段对其进行分离纯化。众所周知，液相色谱(LC)是一种高效的分离手段，所以将HPLC和NMR进行联用是表征混合物的一种强大技术[1]，在中草药分析、高分子领域有着广阔的前景。

然而，LC与NMR的直接联用并不简单，科学家花了很长时间才引入这种耦合，原因有一下几点：首先是NMR的灵敏度较低，为了提高灵敏度需要增大流通池的体积，但增大流通池体积会造成LC的峰展宽；其次，目前NMR所用的溶剂仅限于几种氘代溶剂，以减小溶剂对测量的影响，但如何成功地在各种溶剂中选择最优的溶剂是HPLC需要考虑的重要问题。在实际应用中经常使用的梯度洗脱方法并不适用与NMR检测，适用于NMR的几种溶剂显然无法满足需求，同时氘代溶剂价格昂贵，不适合大量使用。所以LC-NMR联用技术实际上在解决这些问题。

1 LC-NMR的操作模式

如图1(a)中，在流(on-flow)模式为从HPLC的色谱柱流出的洗脱液直接被输送到NMR，核磁共振采集将与色谱一起开始，一系列自由诱导衰变(FID)信号将在HPLC运行的同时获得[2]。因此，这一系列FID信号可以像二维实验中的第一维那样处理，从而得到保留时间—化学位移的等高线图。由于需要在洗脱液快速流经核磁探头时得到核磁共振谱图，因此需要NMR快速的检测，所以这种模式适合分析高浓度样品。第一个on-flow实验是使用了90 MHz的核磁共振波谱仪。仪器配备了含有流通池的流动探针，流动池是最重要的部分，需要调整尺寸以同时适应色谱分离和最佳核磁共振灵敏度。试验所报道的流通池为415 μL，由于超导磁体、低温探针、溶剂压制方法的发展，核磁的灵敏度不断提高，所以现在所需的流通池也变得更小，目前大多数流量探针的有效容积为60～120 μL。

图1(b)显示了停流(stop-flow)模式，停流模式为控制一种组分进入NMR进行检测，检测过程中NMR检测池中溶液不变。当一种组分流入NMR后停止HPLC的泵，使待测物停留在NMR中进行多次扫描(增加扫描次数可以提高NMR的信号)，但停止流动后样品在色谱柱中会发生纵向扩散，造成峰的展宽，所以不适合分析多组分样品。在这种情况下，可以进行溶剂抑制的一维和二维实验。核磁共振实验完成后，流动将自动恢复，色谱将寻找下一个峰随后停泵。此过程将重复进行，直到色谱图结束或程序设定的停止峰结束。

图1(c)和图1(d)展示了循环收集和分析的过程，这个过程也属于停流模式的一种。当HPLC检测器检测到一个峰时，循环延迟计数器将被激活，在某一循环内收集一部分，直到延迟结束，然后接口将切换到下一个循环继续收集。待收集完成后，HPLC系统的某些部分被绕过，只有泵起主要作用，仪器将按照程序将收集管内的样品按顺序进行分析。此模式中需要确定两种延迟：一种为检测器中检测到的最大LC峰值和环路中心之间的时间；另一种为环路到NMR探针的时间。对循环回路的分析将像停流动实验一样，收集管内相应的样品直接输送到流动池，当到达探测延迟时，流量将停止，NMR收到信号开始采集。当最后一次NMR采集实验完成后，泵将恢复流动，并将冲洗出下一个循环进行分析。此方法对样品的分离度要求较高，且储存的溶液会被后续进入的溶液稀释导致灵敏度降低，所以需要样品浓度较高。

图1 LC-NMR的操作模式(虚线为不使用路线)

基于FT-NMR较高的灵敏度，HPLC-NMR实验[3]采用了最容易操作的停流技术，在HPLC和NMR之间增加了介电常数检测器和两个三通阀(如图2(a)所示)。采用四氯乙烷或四氯化碳作为洗脱剂，实现了对三种二甲基苯酚的分离检测。为了解决NMR但灵敏度低，采用停流模式可以将分辨率提高制纳摩量级。在该实验中采用的为第二种方式，实验需首先确定样品从HPLC的检测器到NMR检测器的时间。图2(b)展示了样品从介电常数检测器到NMR出峰的时间，从图2中可以看出NMR相较于HPLC检测器峰明显存在展宽，在后续的实验中均在检测到峰值后52 s开启阀2，使液体不再流入NMR。实验中采用了四氯乙烷和四氯化碳两种洗脱剂进行洗脱(如图2(c)和图2(d)所示)，这两种洗脱剂均不含有1H，从图中可以看出可以实现对2,6-二甲基苯酚、2,3-二甲基苯酚和3,5-二甲基苯酚进行分离。但核磁谱中存在杂质峰，其中四氯乙烷作洗脱剂的杂质峰更复杂，当采用四氯化碳作为洗脱剂时的杂质峰可以通过脉冲去除。

图2 LC-NMR联用设备示意图

2 溶剂峰的压制

前面已经提到，限制LC-NMR发展的一个重大的因素是溶剂的问题。普通的溶剂会在NMR中产生多个干扰信号，使用氘代溶剂不划算且不能应用于色谱，当使用混合溶剂时干扰会更加的严重，所以在NMR技术中发展溶剂峰的压制技术就变得尤为关键。一般来说，应用专门设计的脉冲序列进行核磁共振测量会导致溶剂信号强度显著降低或完全被抑制。

发射预饱和技术(PRESAT)技术为利用一个施加在主脉冲之前的低功率脉冲来抑制溶剂的信号，此脉冲可以将特定频率的质子的Zeeman裂分导致的分布平均化，导致无法显示出核磁的信号。如果需要抑制更多的信号，则可以采用多个通道同时发射不同的频率脉冲对不同的溶剂峰进行预饱和。预饱和需要一定的时间，所以PRESAT技术只能应用在stopflow实验中。

WATERGATE技术使用去相位梯度脉冲、180°反转脉冲和重述梯度脉冲来抑制溶剂信号。WATERGATE脉冲是一个梯度回波序列，一个非选择性的90° RF脉冲均匀地激发所有核的共振，随后的对称回波段由两个具有相同振幅和符号的短场梯度脉冲与中间的180°选择性射频脉冲组成(如图3所示)。所有在第一个场梯度脉冲下退相位，只要在选择性射频脉冲下经历180°旋转，就会被第二个场梯度重新确定相位。如果将选择性180°脉冲设计为溶剂的共振频率，则其净旋转接近零，而其余频率翻转为180°，则在开始采集的那一刻就没有溶剂信号了。形状脉冲明显比以前的脉冲技术所需时间短，所以此技术对on-flow和stop-flow实验均可以使用，也可以与形状脉冲压制13C卫星峰一起应用于on-flow实验。

图3 WATERGATE脉冲方案用于抑制溶剂峰

图3中，射频脉冲和场梯度脉冲分别显示在不同的线上。除了标准的非选择性自旋回波脉冲对外，两个旋转方向相反的选择性90°脉冲和两个形状的磁场梯度被对称地放置在非选择性180°脉冲上。插入四个延迟(△)以允许梯度恢复。

WET序列由四个不同翻转角度的溶剂选择形状脉冲组成，每个形状脉冲后面直接跟着一个退相位梯度脉冲，梯度强度的比率为8∶4∶2∶1(如图4所示)。因此，溶剂核的磁化在获得之前就被抵消了。WET可用于多种溶剂抑制，该实验对on-flow模式特别有用，因为在SEDUCE脉冲的情况下，形状脉冲的整个持续时间通常不超过100 ms，当然此方法也可以用于stop-flow模式的测量。

这些实验是LC-NMR中最常用的解决溶剂峰的方法，当然NMR技术的发展为溶剂抑制实验提供了更多的选择，如：二项式序列、跳跃返回、基于松弛的序列等，优化溶剂峰可以有效地提高NMR的分辨率，为LC-NMR提供更多的支持。

图4中，四个选择性WET RF SEDUCE脉冲的相位为x、y、y和y，梯度脉冲的持续时间为2 ms，振幅为32、16、8和4 G/cm，与下一个RE脉冲间隔为2 ms，场强为100 Hz的选择性碳去耦与选择性H去耦脉冲一同使用。

图4 WET序列应用在1D LC-NMR

3 各种模式LC-NMR的应用

SEC在分析生物大分子和聚合物等方面有着重要的应用，第一个是SEC-NMR实验。这项工作使用了配有60 μL流动池的500 MHz的NMR光谱仪，测定了小等规聚甲基丙烯酸甲酯样品的摩尔质量。NMR可以通过测定引发剂封端的叔丁基的信号来对摩尔量进行直接测定，由于PMMA分子中只有一个叔丁基团，所以可以将积分归一化后与-OCH3基团的信号进行比较从而得到分子量。

毛细管高效液相色谱在于NMR联用技术中有巨大的优势，原因是毛细管的流量很小，可以使用高成本的氘代试剂作为洗脱剂，在天然产物的分离中有着巨大的应用。利用微流NMR对市售的迷迭香提取物的分析，所用的方法为stop-flow模式，所用的洗脱剂为乙腈-d3和D2O进行梯度洗脱。

4 结语

LC作为高效的分离手段，NMR作为准确的结构鉴定手段，两者的联用具有非常广阔的前景，广泛应用在混合物的分离和鉴定中，如中草药成分鉴定、高分子领域。但由于LC与NMR在溶剂、灵敏度等方面由较大的冲突，所以其联用有着较大的困难。解决这些问题的思路主要是通过改进一方来适应另一方。通过改进NMR技术以适用于LC的有提高FT-NMR的频率来增加灵敏度、设计脉冲序列来去除溶剂效应等；通过改进LC来适应NMR的方法有stop-flow模式和循环模式、毛细管色谱采用氘代溶剂等。同时，许多更先进的方法被开发出来，如：低温LC-NMR、微流NMR等，为提高LC-NMR的灵敏度等提供了新的思路。