苹果园噻虫嗪表土残留及其对地表节肢动物的影响

孙艳超，寇弘儒，夏孟婧，董兆克，张志勇*

(1.北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206；2. 中国科学院农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京 100101；3. 青岛农业大学植物医学学院，山东青岛 266109))

苹果在世界经济作物中占有重要的地位，我国的苹果产量和面积位居世界前列(任婷等, 2012; 黄晶淼等, 2020)。目前施用化学农药防治苹果园病虫害是我国最常用的高产技术，但长期不合理的使用化学农药对苹果园环境产生了一定的副作用(冯佳, 2017; 李德强和孟香玲, 2020)。噻虫嗪(Thiamethoxam)是第二代烟碱类高效低毒杀虫剂，对害虫具有胃毒、触杀及内吸活性(赵云, 2016)。虽然2012年瑞士公司在我国登记了21%噻虫嗪悬浮剂，至今并未登记在苹果生产中施用，但实际上该药已被广泛应用于防治苹果园蚜虫、叶蝉等害虫(谭丽超等, 2020)。目前，关于噻虫嗪的残留及其安全性已受到关注，在蔬菜(汤富彬等, 2008; Gongetal., 2012; Karmakaretal., 2012; 蒋梦云, 2018)、甘蔗(Abdeletal., 2016; 郇志博等, 2018)、西瓜(Valenteetal., 2019)、马铃薯(Kumaretal., 2014)、小麦(吴绪金, 2014; 陈国峰, 2018)、葡萄(张怡等, 2015)等多种作物上已有相关研究报道，本课题组对该药对苹果膳食风险也进行了初步评估(戈文学等, 2015)。

节肢动物在果园生态系统中普遍存在，是重要的授粉者或食物链传递者，对果园生态平衡的维系有着重要作用，其中地表植被及土壤表层中的双翅目Diptera、弹尾目Collembola、膜翅目Hymenoptera昆虫和蜘蛛目Araneae等蜘蛛类节肢动物对新烟碱类农药比较敏感，受到此类农药影响，其繁殖能力通常下降甚至大量死亡，常常被作为果园生态安全的指示生物加以研究(Henryetal., 2012)。由于这些非靶标生物主要生活在土壤表层或地表植被中，研究地表土层中农药的沉积和残留对这些生物的影响是多数农药生态安全评估的重要切入点(张淑花等, 2015)。前人的研究表明，高效液相色谱法(王多娇等, 2014)、超高压液相色谱串联质谱法(Xiaoetal., 2013)、液相色谱串联质谱法(万超超等, 2018)均适合于噻虫嗪的残留分析，但样品前处理不同的方法对结果影响较大。QuEChERS技术(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年来发展的一种快速前处理技术，该方法利用乙腈等有机试剂和NaCl等盐析剂进行提取，促使目标物转移至有机相中，能够减少分析时间和有毒溶剂使用量。虽然该方法具有简单、灵敏、高效的特点，适用于土壤基质中农药残留检测的前处理，但因土壤表层组分受不同成分理化性质和植被的影响，QuEChERS技术条件在实践中通常需要优化(贺泽英等, 2020)。

为了研究北京地区苹果园使用噻虫嗪可能存在的风险，本文采用QuEChERS技术优化了噻虫嗪土壤样品的前处理条件，建立了检测土壤中噻虫嗪残留的分析方法，并据此测定了噻虫嗪在苹果园土壤中的残留动态，同时观察了苹果园地表的双翅目、膜翅目和蜘蛛目等节肢动物种群数量及多样性变化，以期为该药剂在北京地区苹果园中应用的生态风险评估提供进一步科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试剂药品：噻虫嗪标准品(纯度99.6%)，CATO公司；色谱纯甲醇，CNW公司；色谱纯乙腈，CNW公司；21%噻虫嗪悬浮剂，江苏辉丰农化股份有限公司；其余试剂均为分析纯。

仪器设备：Agilent 1200液相色谱仪(DAD检测器，Agilent色谱工作站)，美国安捷伦公司；SHB-III型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；LABOROTA 4001 efficient 旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；3wBD-16型背负式电动喷雾器，台州市路桥明辉电动喷雾器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1大田试验

试验地条件：田间试验在北京市昌平区南口镇南口农场果园进行。试验地土壤为砂壤土，肥力中等；土壤pH值7.0左右，供试苹果园品种为红富士。该果园在此试验之前此未施用过噻虫嗪。

小区设计：按照NY/T 788-2004《农药残留试验准则》(刘光学等, 2004)和《农药登记残留田间试验标准操作规程》(王运浩, 2007)，于2019年 6月进行。以喷雾方式施用推荐剂量的21%噻虫嗪悬浮剂1次，设置清水对照，共两个处理，每处理3个小区，每个小区100 m2，苹果树株距3 m、行距4 m，每个小区8棵苹果树，小区之间设置保护行，施药剂量为31.5 g a.i./ha。

消解动态试验: 采用1次施药多次采样的方法，施药剂量为31.5 g a.i/ha(推荐剂量)土壤处理小区在药后的1、3、5、7、10、14、21、28 d及收获期采集土壤样品去除石砾和枯枝落叶。土壤样品采集方法参照《农药登记残留田间试验标准操作规程》(王运浩, 2007)。

1.2.2地表节肢动物的调查

陷阱法：将深度为13 cm，口径为6 cm的杯埋在苹果园地面，杯口与地面平齐，内装有少量的75%酒精和洗涤灵混合液。每个处理区设立8个样点，每个样点各埋设1个杯，噻虫嗪处理区和对照区共设置16个陷阱。在药后1、3、5、7、14、21、28 d进行调查取样，提前一点设置采样陷阱杯，1 d后回收样本，将样本转入95%乙醇溶液的20 mL离心管中保存，供进一步鉴定(李依林, 2008)。

地表节肢动物鉴定根据《中国土壤动物检索图鉴》(尹文英等, 1998)《中国昆虫生态大图鉴》(张巍巍等, 2011)等，在立体显微镜下对收集到的节肢动物标本带回室内进行分类鉴定与统计以“目”为单位进行统计分析。

1.3 土壤中噻虫嗪残留样本及制备

1.3.1方法一

准确称取过20目筛的土壤样品5.00 g，分别添加0.1、0.5、1.0 mg/L的标准溶液，置于50 mL离心管中，吸取25.0 mL分析纯乙腈、称取6.0 g氯化钠，涡旋2 min，超声振荡提取30 min，4 000 r/min离心10 min，准确吸取上清液10.0 mL置于50 mL圆底烧瓶中，减压浓缩(40℃)至干，用2.0 mL甲醇重新溶解后过0.45 μm有机滤膜，待测(郇志博等, 2018)。

1.3.2方法二

改进1.3.1的前处理方法，称取过20目筛的土壤样品称取1.00 g，分别添加0.1、0.5、1.0 mg/L的标准溶液，置于15 mL离心管中，6 mL分析纯乙腈提取，加入1 g NaCl盐析，涡旋2 min，10 000 r/min离心5 min。取上清5 mL，旋转蒸发仪(40℃)浓缩近干。吸取1 mL乙腈溶解，过0.45 μm滤膜，待测。

1.4 样品分析

1.4.1标准曲线的建立

称取0.1000 g噻虫嗪标准品，用色谱纯甲醇配成1 000 mg/L的标准储备液冷藏备用。所有试剂在-4℃冰箱中保存。将噻虫嗪储备液用色谱纯甲醇稀释成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 mg/L标准液，在稳定的色谱条件分别进样5 μL，得到噻虫嗪各进样浓度及相应峰面积，以此得出线性关系。

1.4.2色谱的检测条件

Agilent 1200高效液相色谱仪(二极管阵列检测器及Agilent化学工作站)和XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相比例为乙腈 ∶ 水=15 ∶ 85，流速为1.0 mL/min,柱温30℃，进样量5 μL，检测波长为254 nm。

1.4.3方法验证

准确度：添加回收率是衡量农药残留量检测方法准确度的重要指标。在土壤空白样品中添加质量分数为0.1、0.5、1.0 mg/L的噻虫嗪标准液，每个添加浓度重复5次，然后按照前处理方法提取净化并定容。按照1.3分析方法，计算添加回收率和相对标准偏差。

精密度：在上述稳定的色谱条件下，待仪器稳定后，连续对添加浓度1 mg/L噻虫嗪标准溶液的同一样品进行6次平行测定。

1.5 数据处理

数据处理分析主要采用Excel、SPSS 24.0软件进行。采用如下公式对节肢动物多样性指数进行分析(Adans, 1985)。

1.5.1Shannon-Wiener多样性指数H′，计算公式：

1.5.2Pielou均匀度指数群落J，计算公式：

对添加10%氧化硼后液相渣中各相的含量进行分析，如图3所示。当温度超过700 ℃后，各相含量突然升高。在800 ℃时，CaO和MgO的百分含量接近100%，即矿中的CaO和MgO全部进入液相渣中。900 ℃时SiO2的百分含量达到88.2%，即矿中的SiO2大部分进入液相渣中。在800 ℃后，随着温度的升高，矿中的Al2O3也逐渐的进入液相中。除Al2O3持续增加外，各相含量在900 ℃时趋于稳定。

式中N为群落中所有种类的个体总数，ni为第i各类群的个体数量，Pi=ni/N，s为群落类群数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性范围

将色谱纯甲醇配置100 mg/L的噻虫嗪标准贮备液，稀释至0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的标准溶液。在稳定的色谱条件下分别进样5 μL，得到噻虫嗪各进样浓度及相应峰面积。根据不同进样浓度和相应峰面积大小得出的标准曲线图1所示。线性方程为y=17.129x-0.453，相关系数r=0.9997(n=8)，在0.1～20 mg/L范围内，标准曲线呈良好的线性关系。

图1 噻虫嗪标准曲线Fig.1 Standard curve of thiamethoam

2.2 方法的准确度、精密度

2.2.1方法准确度

在土壤样品中，添加质量分数为0.1、0.5、1.0 mg/L的噻虫嗪标准溶液，然后按照上述两种方法提取、净化、定容，其检测结果见表1。

两种前处理方法中，方法一中不同添加水平下噻虫嗪的平均添加回收率为103.17%～108.03%，变异系数为3.17%～6.49%，方法二中不同添加水平下噻虫嗪的平均添加回收率为92.03%～94.18%，变异系数为2.91%～6.04%，两种方法均满足残留分析的要求。

方法二根据QuEChERS原理，改取土壤样品的用量为1.0 g，在减少样品用量的同时，还减少了乙腈与氯化钠的用量；利用涡旋与离心促使农药更充分地与乙腈溶解并与土壤样品分层；取消振荡提取30 min，用10 000 r/min离心5 min代替4 000 r/min离心10 min，既节省时间又实现了明显分层。

2.2.2仪器的精密度

在上述稳定的色谱条件下，待仪器稳定后，连续对浓度1 mg/L的噻虫嗪标准溶液进行6次平行测定(表2所示)，噻虫嗪峰面积平均值为16.67 mAU·s，变异系数为1.24%，表明该方法重现性好。

表1 两种前处理方法的添加回试验的比较

表2 仪器精密度测定

2.3 噻虫嗪在土壤中的消解动态及最终残留量

噻虫嗪在苹果冠层下的土壤中的残留最大值及其出现时间、消解动态方程、相关系数和消解半衰期见图2。在喷施推荐剂量噻虫嗪(有效成分31.5 g a.i./ha)后，噻虫嗪在土壤中的前期消解速率较快，常规推荐剂量下的动力学方程为C=2.3421e-0.11t(r=0.9489)，消解半衰期为6.36 d。在消解动态试验中，推荐剂量的初始残留量分别为2.44 mg/kg，药后7 d的残留量为1.13 mg/kg，即药后21 d，消解率均超过88%，28 d之后，土壤样品未检测到噻虫嗪残留。

图2 噻虫嗪的最终残留动态Fig.2 Residual dynamics of thiamethoxam in soil

2.4 噻虫嗪地表沉积对地表节肢动物群落多样性的影响

苹果园喷施噻虫嗪后不同时间地表节肢动物的Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数见图3。苹果冠层喷施噻虫嗪在地表的沉积后，21 d内对节肢动物多样性的影响较为明显，Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数两个指标施药后变化趋势一致，且施药区一直低于对照区，直到28 d后趋于恢复。

图3 喷施噻虫嗪后不同时间对节肢动物群落多样性Fig.3 Effects of diversity index of arthropod community in different periods after thiamethoxam application

2.5 药后沉积对地表典型节肢动物种群数量的影响

施药后噻虫嗪对地表典型节肢动物蜘蛛目、鞘翅目、双翅目、弹尾目等类群数量的影响见图4。在药后1 d对蜘蛛种群数量有显著的抑制作用，药后3 d开始药剂处理区与空白对照区的类群数量均差异不显著；鞘翅目甲虫类类群数量在药后3 d药剂处理显著低于空白对照区，从药后第5天开始其它时间药剂处理区与对照区的类群数量均差异不显著；双翅目和弹尾目跳虫的类群数量在施药后1 d开始药剂处理区并不显著低于空白对照区。其中药后1 d弹尾目跳虫的类群数量还略高于空白对照区，表明施药对跳虫影响不大。

综上所述，苹果园喷施噻虫嗪防治苹果蚜虫类害虫，对土壤蜘蛛、鞘翅目甲虫类类群数量5 d内有显著抑制作用；对双翅目、弹尾目类昆虫种群数量抑制作用较小。

图4 噻虫嗪节肢动物的影响Fig.4 Effects of thiamethoxam on arthropods注：A，蜘蛛目；B，鞘翅目；C，双翅目；D，弹尾目。同一时间样本结果字母不同者表示处理区和空白对照区存在显著统计差异。Note: A, Araneae; B, Coleoptera; C, Diptera; D, Collembola. Means with different letters at the same time were statistically significant differences in the treatment area and the control area.

3 结论与讨论

利用QuEChERS原理改进的前处理方法通过缩小取样体积、节约试剂，缩短了提取时间，提高了实验效率，适合高效液相色谱分析。实验结果说明由此建立的噻虫嗪土壤残留分析方法适用于苹果园噻虫嗪土壤残留的分析，能够达到相关分析标准的要求。

苹果园喷雾施用噻虫嗪后该药沉降到地表，在土壤中能够快速消解，其残留动态符合一级动力学模型。前人报道在甘蔗园中土壤的半衰期为6.22 d(郇志博等, 2018)，在茶园土壤中的半衰期5.5 d(吴小毛等, 2013)，在小麦田土壤中的半衰期5.3 d(陈国峰等, 2018)，在葡萄园土壤中的半衰期为7～10 d(张怡等, 2015)，本研究测得噻虫嗪在北京地区苹果园土壤中的半衰期为6.36 d，其降解趋势与前人有关研究也基本一致。但也不难看出，噻虫嗪在不同植被的土壤中降解速率存在一定差异，这些差异的成因与不同植被、不同土壤理化性质以及不同植物根际微生物群系有关。在北京地区，噻虫嗪于苹果园的用药时间在5-6月份，冠层喷雾28 d后地表土壤中的残留即难以检出，此时距苹果采收期远超50 d。虽然对于苹果果品而言，噻虫嗪应用的膳食风险应在可控范围，但此时正置天敌昆虫、传粉昆虫及其它非靶标生物大量发生季节，其生态安全风险尚需进一步评估。

苹果园地表存在丰富的节肢动物种类，是稳定苹果园生态系统的重要成员，也是苹果园农药生态安全风险评估的重要指标。侯有明、张淑花等研究报道杀虫剂对蜘蛛和鞘翅目甲虫、双翅目、弹尾目类群的影响尤为明显(侯有明等, 2001; 张淑花等, 2015)。李冠楠等研究报道玉米田中吡虫啉导致肢动物群落多样性和均匀度下降(李冠楠等, 2018)。本研究结果表明，苹果园施用噻虫嗪对地表典型节肢动物的生物多样性指数在28 d内有降低作用，对蜘蛛、鞘翅目甲虫等种群数量施药后3～5 d的短期内也存在显著的影响，表明这些节肢动物对噻虫嗪短期内比较敏感；噻虫嗪本身在苹果园表土层中也会较快降解，半衰期后的较低残存剂量对监测的节肢动物影响不大，这些现象值得果园施用此类农药风险评估的高度重视。

在试验中还发现，苹果园地表跳虫类及双翅目昆虫受局部环境湿度影响较大，对这两类节肢动物的采样精度带来一定影响，值得今后调查中注意。

致谢：在试验过程中农业应用新技术北京市重点实验室杨柳老师、王进忠老师、李春娜、李成和孙鹏远同学帮助，特此致谢!