石斛内生菌的研究进展

刘雪

摘 要：石斛是“药食同源”的传统名贵中药材，其含有的内生菌种类丰富。石斛内生菌在与宿主石斛长期共生中，对石斛的生长发育、抗逆境、活性代谢产物的合成有促进作用。本文简述了目前石斛内生菌资源及对石斛促生作用的研究结果，展望问题及研究方向，以期为石斛及内生菌的开发利用提供依据。

关键词：药用石斛;内生菌;研究进展

Research Progress of Endophytic Bacteria in Dendrobium

LIU Xue

（Jinan Food and Drug Inspection Center， Jinan 250000， China）

Abstract： Dendrobium is a traditional and precious Chinese medicinal material with“medicine food homology”， and it contains abundant endophytic bacteria. In long-termsymbiosis， endophytic bacteria can promote the growth and development， stress resistance and the synthesis of active metabolites of Dendrobium. This paper briefly describes the current research results of endophytic bacteria resources and their promoting effects on Dendrobium， and prospects the problems and research directions， in order to provide a basis for the development and utilization of Dendrobium and endophytic bacteria.

Keywords： Dendrobium; endophytic bacteria; research progress

石斛（Dendrobium）为附生型多年生草本植物，为兰科最大的属之一，主要有铁皮石斛、流苏石斛、环草石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和黄草石斛等，在我国主要分布于秦岭-淮河以南，集中在云、贵、桂、琼、粤和台等地区。石斛是传统名贵药材，《神农本草经》记载其“味甘，平”“久服厚肠胃，轻身延年”。2020版《中国药典》记载，石斛具有益胃生津，滋阴清热的功效。现代科学研究证明石斛含有丰富的多糖、生物碱、黄酮、倍半萜类和菲类等活性成分，在抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和增强抵抗力等方面作用显著。因其良好的食用和药用效果，石斛被国家药监局列入“药食同源”名单。

植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物的各种组织和器官内部，对寄主植物产生直接或间接作用，不会引起明显病害的一类微生物群。石斛内生菌是影响石斛生长与药效的重要生态因素之一，近年来学者对石斛内生菌的分离鉴定及其与石斛的互惠共生关系进行研究，取得了较为丰富的成果。

1 石斛内生菌

石斛内生菌资源丰富，在植株的根茎叶中都有分布，目前研究主要集中于铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛、齿瓣石斛、束花石斛、美花石斛和细茎石斛等药用石斛方面。不同石斛由于品种及生存环境等差异，其内生菌的种类和数量差别较大，野生石斛内生菌物种多样性指数高于人工栽培品种。

1.1 石斛内生真菌

自20世纪发现石斛内生菌开始，学者先后从铁皮石斛、美花石斛、金钗石斛等石斛中分离出众多内生真菌，形成了较为成熟的分离鉴定方法[1]。石斛内生真菌的种群丰富多样，主要有担子菌亚门、子囊菌亚门和半知菌亚门，涵盖小菇属、丝核菌属、木霉属、柱孢霉属和头孢霉属等近60个属[2]。石斛内生真菌有一定的宿主及组织特异性，不同品种及同一品种不同组织中的内生真菌差异较大。严亮等[3]研究云南栽培的铁皮石斛，发现其根部的内生菌的種类、数量最多。有学者从金钗石斛中发现14个属的内生真菌，且在叶组织中分布数量最多[4]。柴晓蕾等[5]研究华石斛野生植株内生真菌，发现叶中分离出的菌株数最多。这些差异可能与宿主石斛的基因、生长环境、生长年限等因素有关，也可能与筛选方法等操作因素有关。

1.2 石斛内生细菌

石斛内生细菌主要有厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和梭杆菌门，涵盖芽孢杆菌属、肠杆菌属、土壤杆菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属、短小杆菌属等近50个属，在多个石斛品种中，芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属为优势菌群。研究表明，石斛内生细菌表现出地区、种属特异性及组织偏嗜性，与药材的道地性相符合。童文君等[6]从不同产地美花石斛的不同部位中分离出内生细菌67株，分布情况为茎部多于根部和叶部，来自广西的种类数多于云南和广东。王明月等[7]对人工种植的铁皮石斛研究发现，其根组织中内生细菌数量高于茎和叶，且格氏沙雷氏菌和苏云金芽孢杆菌仅存在于根组织。

1.3 不可培养内生菌

由于培养条件等因素限制，传统方法只能筛选到植物内生菌的1%左右。随着现代分子生物学技术的发展，DNA测序、荧光标记、酶联免疫反应等技术在内生菌的鉴定、“不可培养内生菌”的研究方面实现了新突破。通过高通量测序可构建不同品种石斛的内生菌cDNA文库，使筛选更准确、高效。有学者通过MiSeq高通量测序技术分析铁皮石斛的内生细菌，检测到低丰度的、从未分离鉴定过的瘤胃球菌属、布赫纳氏菌属等细菌类群[8]。通过微生物多样性测序技术，王珊珊等[9]从6种石斛茎部组织中检测到从未报道过的丛毛单胞菌属及罗尔斯通菌属菌株。分子生物学技术尤其是DNA测序和基因图谱等技术为石斛内生菌的研究提供了新的思路和方向。

2 石斛内生菌的作用

2.1 促进石斛植株的生长发育

石斛作为兰科植物，种子没有胚乳，其生活史与微生物的共生关系十分紧密。在长期的系统演化过程中，内生菌既可产生植物激素、维生素等促进石斛的生长发育，又可增强石斛对水分和矿质元素的吸收。在铁皮石斛、金钗石斛、齿瓣石斛等筛选到的多种内生菌都对石斛的萌发、生长有显著促进作用。SHAH等[10]从细茎石斛中分离到内生真菌R10，研究发现其能产生相对较高的植物生长素吲哚乙酸。金辉等[11]将内生瘤菌根菌人工接种至铁皮石斛的组织培养苗，发现接菌苗的B、Fe、Cu和Mn等多种营养元素含量有所增加，其中B、Si元素含量分别增加了7.8倍和5.3倍。把从野生铁皮石斛中分离的内生菌接入人工栽培植株，可提高栽培铁皮石斛内生菌多样性，还能使石斛在转录水平上的代谢途径发生基因差异表达。

2.2 增强石斛的抗逆性

石斛内生菌能够增强宿主植物抵抗病原菌和抗干旱能力。部分石斛内生菌有较强的抗病原菌能力，金钗石斛和流苏石斛中均发现能产生广谱抗菌活性物质的内生细菌。朱江敏等[12]发现石斛内生木霉菌能够抑制病原真菌镰刀菌，能有效提高石斛抗病能力。除通过分泌抗生素类物质外，石斛内生菌还能通过产生水解酶、毒性生物碱，或者生态竞争营养等途径实现抗病性，是研发新型天然抗生素的宝贵资源。研究发现美花石斛的内生菌有较广的pH适应范围，还能诱导石斛产生能参加抗性反应的小分子酚类化合物，从而抵抗恶劣环境，这也是多数石斛能生长在树皮上、石灰岩基质中的重要因素。

2.3 促进石斛活性代谢产物的合成

药用石斛中生物碱、多糖、黄酮类和联苄类是主要的次生代谢产物，研究发现内生菌能够影响宿主石斛的次生代谢水平、诱导次生代谢产物的合成。CHEN等[13]发现石斛内生菌小菇属MF24菌株和瘤菌根属MF15菌株可使金钗石斛的多糖含量分别提高76.7%和153.4%。WU等[14]从铁皮石斛分离内生菌并用其侵染栽培植株，明显提高了栽培植株莖部的多糖及叶部的酚类、黄酮类的含量。用石斛内生菌MF23侵染金钗石斛后，可通过调节甲羟戊酸途径中与生物碱合成相关的基因的表达，增加金钗石斛生物碱的合成[15]。研究认为内生菌通过一种化学信号诱导因子，能快速且特异性地诱导石斛植株特定基因表达、激活特定次生代谢途径，促进相应成分的合成和积累。

2.4 产生其他功能性产物

现代研究证明石斛内生菌能产生多种功能性产物，石斛内生菌具有与药用石斛相似的镇痛消炎作用，从石斛内生菌石斛小菇发酵产物中提取出有明显镇痛作用的单体化合物β-谷甾醇和麦角甾烯氧化物。WU等[16]研究发现分离自铁皮石斛内生真菌DO14代谢产物的5种化合物，对两种人癌细胞（LOVO细胞、HL-60细胞）有不同程度的抑制作用。有的内生菌可以代谢出天然色素，如铁皮石斛内生真菌H1B1可分泌耐高盐高糖的水溶性红色素[17]。多样性的代谢产物对医药资源及工业生产具有重要研究价值。

3 结语

石斛内生菌在宿主石斛的生长及代谢中起着不可替代的作用，加强对内生菌的研究利用对保护石斛资源、拓宽其生物多样性具有重要意义。目前，石斛及其内生菌相互作用机制、多种内生混合菌株的协同机制尚不明确，有效利用内生菌资源提高石斛的品质有待继续探究，其在石斛内生菌代谢产物的药理作用、有关功能基因的克隆与表达、大规模发酵培养提取相关功能性成分等方面，将有重要的理论和现实意义。

参考文献

[1]郭顺星，曹文芩，高微微.铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J].中国中药杂志，2000，25（6）：333-341.

[2]徐焰平.铁皮石斛内生真菌研究进展[J].微生物学杂志，2015（5）：108-112.

[3]严亮，杨瑞娟，王桥美.云南铁皮石斛内生菌的分离与鉴定[J].云南农业大学学报（自然科学版），2015，30（5）：

760-765.

[4]YUAN Z L，CHEN Y C，YANG Y.Diverse non mycorrhizal fungal endophytes inhabiting an epiphytic， medicinalorchid （Dendrobium nobile）： estimation and characterization[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2008，25（2）：295-303.

[5]柴晓蕾，宋希强，朱婕.华石斛内生真菌组织分布特点及其抑菌活性[J].热带作物学报，2018，39（1）：137-144.

[6]童文君，张礼，薛庆云，等.不同产地美花石斛内生细菌分离及促生潜力比较[J].植物资源与环境学报，2014，23（1）：16-23.

[7]王明月，陶茜，李克艳，等.铁皮石斛内生细菌群落结构分析[J].西部林业科学，2014，43（5）：106-111.

[8]陈泽斌，李冰，高熹，等.铁皮石斛不同部位内生细菌群落高通量分析[J].河南农业科学，2017，46（11）：98-102.

[9]王珊珊，刘佳萌，孙晶，等.药用石斛内生菌的研究进展[J].中国食物与营养，2020，26（7）：35-40.

[10]SHAH S，SHRESTHA R，MAHARJAN S，et al.Isolation and characterization of plant growth-promoting endophytic fungi from the roots of Dendrobium moniliforme[J].Plants（Basel），2019，8（1）：5.

[11]金輝，许忠祥，陈金花，等.铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用[J].植物生态学报），2009，33（3）：433-441.

[12]朱江敏，赵英梅，白坚，等.石斛共生真菌木霉菌拮抗作用的初步研究[J].杭州师范大学学报（自然科学版），2011，10（4）：340-344.

[13]CHEN X M，DONG H L，HU K X，et al.Diversity and antimicrobial and plant-growth-promoting activities of endophytic fungi in Dendrobium loddigesii Rolfe[J].Plant Growth Reg，2010，29（3）：328.

[14]WU L S，DONG W G，SI J P，et al.Endophytic fungi，host genotype，and their interaction influence the growth and production of key chemical components of Dendrobium catenatum[J].Fungal Biol，2020，124（10）：864-876.

[15]LI Q，DING G，LI B，et al.Transcriptome analysis of genes involved in dendrobine biosynthesis in Dendrobium nobile Lindl.infected with mycorrhizal fungus MF23（Mycena sp.）[J].Sci Rep，2017，7（1）：316.

[16]WU L S，JIA M，ZHU B，et al.Cytotoxic and antifungal constituents isolated from the metabolites of endophytic fungus DO14 from Dendrobium officinale[J].Molecules，2016，21（1）：14.

[17]刘维，阮璐雅，管成林，等.一株铁皮石斛内生真菌H1B1产红色素稳定性的研究[J].中国食品添加剂，2016（1）：71-75.