卵白蛋白肽复合酶法制备工艺优化及解酒效果

齐兴宇 闫小娟 张海悦

(1. 长春工业大学，吉林 长春 130000；2. 吉林省富生特医食品有限公司，吉林 长春 130607)

小分子肽可被用作解酒产品[1-2]。其解酒护肝的作用机理包括：提高人体内乙醇脱氢酶(ADH)的活性以加快酒精的代谢速度；清除在酒精代谢的过程中产生的大量自由基从而降低酒精对肝脏的损伤[3-4]。另外，有研究[5]发现肽类物质中含有的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸有利于合成乙醇代谢酶并减轻醉酒症状。目前已有的小分子肽类解酒产品主要以植物或海产品中的蛋白质为原料，但其蛋白组分常为难以纯化的复杂蛋白，影响酶解效果[6-7]。卵白蛋白是鸡蛋清中含量最丰富的一种蛋白质，含有人体所需的所有必须氨基酸，是制备活性肽的理想原料[8]。目前，卵白蛋白的纯化方法已经相当成熟，蛋白酶解时的利用率更高[9]。研究拟用碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解得到卵白蛋白肽，以瓦勒—霍赫法来评价卵白蛋白肽的体外促乙醇代谢能力[10]，以ADH激活率为响应因素[11]，采用响应面法优化酶解工艺，并测定卵白蛋白肽的总抗氧化能力、水解度、氨基酸组成及相对分子质量的分布情况，旨在验证卵白蛋白肽的解酒活性，为提高鸡蛋产品的附加值提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵白蛋白：实验室自制；

牛胰蛋白酶(250 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)、乙醇脱氢酶(2 500 U/mL)、茚三酮：上海源叶生物科技有限公司；

总抗氧化能力试剂盒、ADH激活率试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器设备

电子天平：FA2104A型，上海精天电子仪器有限公司；

台式高速离心机：TG16G型，湖南凯达科学仪器有限公司；

冷冻干燥机：FD-IA-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

pH计：3C型，上海雷磁仪器厂；

紫外可见光分光光度计：UV5500PC型，上海元析仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，常州天瑞仪器有限公司；

集热式搅拌器：DF-101S型，金坛市科析仪器有限公司；

旋涡混合器：XH-B型，江苏天翎仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵白蛋白肽制备 取1 g卵白蛋白于25 mL离心管中，用15 mL蒸馏水溶解，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶各4 000 U/g，用0.5 mol/L的NaOH溶液将体系pH值调为9.0[12]，放入50 ℃恒温摇床中酶解5 h，酶解过程中每30 min调一次pH值。酶解结束后立即在90 ℃水浴下加热10 min使酶灭活，然后迅速冷却到4 ℃以4 000 r/min 离心5 min，取上清液冷冻干燥得到卵白蛋白肽粉末[13-14]。

1.3.2 乙醇脱氢酶(ADH)激活率的测定 按瓦勒—霍赫法[15]及ADH试剂盒方法执行。在试管中加入1.5 mL的焦磷酸钠缓冲液(pH 8.8)，1.0 mL 0.027 mol/L的氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)，0.1 mL卵白蛋白肽冻干前的上清液和0.5 mL 体积分数11.5%的乙醇溶液，混匀，25 ℃保温5 min，立即加入0.1 mL 0.25 U/mL的乙醇脱氢酶(ADH)，混匀，测定340 nm处的吸光度，双蒸水调零。5 min后观察340 nm处吸光度的变化以确定生成的还原型辅酶Ⅰ(NADH)量。以蒸馏水代替卵白蛋白肽溶液进行空白对照。按式(1)计算ADH激活率。

(1)

式中：

WADH——ADH激活率，%；

A1,420 nm——样品在450 nm处的吸光度；

A0,420 nm——对照溶液在450 nm处的吸光度。

1.3.3 总抗氧化能力的测定 将总抗氧化能力试剂盒中的试剂1、试剂2、试剂3按体积比7∶1∶1混合，37 ℃下水浴15 min，取900 μL混合液置于1.5 mL离心管中，加入30 μL卵白蛋白肽上清液和70 μL蒸馏水，同时以相同体积蒸馏水设置空白对照，将样品充分混匀，在37 ℃下反应10 min，测定520 nm处的吸光度值。按式(2)计算卵白蛋白肽总抗氧化能力。

(2)

式中：

M——卵白蛋白肽总抗氧化能力；

A1,520 nm——样品在520 nm处的吸光度；

A0,520 nm——对照溶液在520 nm处的吸光度。

1.3.4 水解度的测定 参照茚三酮显色法并根据文献[16]稍作修改。分别取0.1 g卵白蛋白与卵白蛋白肽粉末用蒸馏水定容到10 mL，取0.2 mL样品，加入0.8 mL蒸馏水，1 mL显色剂。混匀后沸水浴加热15 min。待溶液冷却后加入5.0 mL体积分数40%的乙醇溶液混匀，静置15 min后测定570 nm波长处的吸光度。以甘氨酸标准曲线计算酶解前后样品溶液中游离氨基酸的含量，并采用微量凯氏定氮法测定卵白蛋白中氨基酸的总量。按式(3)计算卵白蛋白水解度。

(3)

式中：

H——水解度，%；

w1——酶解后卵白蛋白的游离氨基酸含量，g；

w2——酶解前卵白蛋白的游离氨基酸含量，g;

w3——卵白蛋白中含有的氨基酸，g。

甘氨酸标准曲线如图1，回归方程为Y=0.024 85X+0.114 52，R2=0.999 2。

图1 甘氨酸标准曲线Figure 1 Glycine standard curve

1.3.5 卵白蛋白肽的相对分子质量测定 按GB 31645—2018执行。

1.3.6 游离氨基酸组成测定 按GB 5009.124—2016执行。

1.3.7 单因素试验

(1) 酶解时间：设定酶解温度50 ℃，复合酶用量3 000 U/g，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3∶25 (g/mL)，测定不同酶解时间(2，3，4，5，6 h)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(2) 复合酶用量：设定酶解温度50 ℃，酶解时间4 h，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3∶25 (g/mL)，测定不同复合蛋白酶(双酶配比为1∶1)用量(2 000，2 500，3 000，3 500，4 000 U/g)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(3) 酶解温度：设定酶解时间4 h，复合酶用量3 000 U/g，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3∶25 (g/mL)，测定不同酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(4) 料液比：设定酶解温度50 ℃，复合酶用量3 000 U/g，酶解时间4 h，测定不同料液比[m卵白蛋白∶V蒸馏水分别为1∶25，2∶25，3∶25，4∶25，5∶25 (g/mL)]下卵白蛋白肽ADH激活率。

1.3.8 响应曲面法优化试验 根据单因素试验结果，选择酶解时间、复合酶用量、酶解温度、料液比作为响应面试验因素，以ADH激活率为响应值，设计四因素三水平响应面优化试验。

1.4 数据处理

采用Origin 8.0软件绘图并进行数据处理，运用Design Expert 13.0软件进行响应面设计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图2(a)可知，随着酶解时间的增长，卵白蛋白肽的ADH激活率也逐渐升高，当酶解时间达5 h左右时，ADH激活率达到峰值，此时蛋白质中的作用位点基本水解完毕。随着产物浓度的增加以及底物浓度的降低，酶促反应的速率逐渐下降[17]。继续延长酶解时间也会对肽的活性造成负面影响。将酶解时间控制在5 h左右时，卵白蛋白肽的ADH激活率为18.9%。

由图2(b)可知，当复合酶用量达3 000 U/g时，卵白蛋白肽的ADH激活率最高，底物基本已经被水解完毕，继续增加酶量对ADH激活率无影响[18]。兼顾到成本，选择酶用量在3 000 U/g左右，此时卵白蛋白肽的ADH激活率为21.1%。

由图2(c)可知，当酶解温度为50 ℃时，卵白蛋白肽ADH激活率达到峰值，酶解温度大于50 ℃时，ADH活性下降，这是由于高温破坏了蛋白酶的结构，导致其变性失活[19]。因此，把酶解温度设置在50 ℃附近较为合适，此时卵白蛋白肽的ADH激活率为19.9%。

由图2(d)可知，在料液比达到3∶25 (g/mL)之前，ADH激活率随着料液比的增加而上升，当料液比大于3∶25 (g/mL)时，ADH激活率下降，可能原因是酶的浓度不足且溶液中的蛋白质分子未完全展开，导致酶活性位点未与蛋白质分子充分接触。继续增大料液比会造成原料的浪费[20]。因此，选取料液比为3∶25 (g/mL)，此时卵白蛋白肽的ADH激活率为20.6%。

图2 各因素对卵白蛋白肽ADH激活率的影响Figure 2 Effects of various factors on the activation rate of ovalbumin peptide ADH

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计与结果 根据单因素试验结果，在料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3∶25 (g/mL)，复合酶用量3 000 U/g，酶解温度50 ℃，酶解时间5 h的条件下得到的ADH激活率最高。因此，以酶解时间(A)、复合酶用量(B)、酶解温度(C)、料液比(D)为变量因素，以ADH激活率(Y)为响应值，进行四因素三水平的响应面设计试验，确定卵白蛋白的复最佳酶解工艺条件，响应面试验因素水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 响应面优化实验因素水平表Table 1 Levels of the response surface optimization test factors

将表2数据用Design Expert 13.0软件经过回归拟合后，得到二次多项回归方程：

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Design scheme and results of the response surface

Y=22.51+0.866 7A+0.525B+0.918 3C+1.21D-0.577 5AB-0.227 5AC+0.520 0AD+1.37BC+0.425BD+0.245CD-2.2A2-2.52B2-3.41C2-3.93D2。

(4)

由表3可知，回归方程模型极显著(P<0.01)，方程失拟项不显著(P>0.05)，回归模型与实测值能较好拟合。决定系数R2=0.956 2>0.9，说明模型拟合程度较高，准确可靠，因此，该模型的拟合值可以用来分析卵白蛋白的最佳酶解条件。通过显著性分析可知，酶解时间、酶用量对卵白蛋白肽的ADH激活率影响显著。酶解温度、底物浓度对卵白蛋白肽的ADH激活率影响极显著，由回归系数F值可知，各因素对卵白蛋白酶解制备活性肽的影响程度为D>C>A>B。

表3 响应面回归方程方差分析†Table 3 Analysis of variance of response surface regression equation

2.2.2 响应面交互分析 由图3可知，CD的响应面陡峭，说明底物浓度和酶解温度相互作用显著，酶解时间和酶用量交互作用相对较弱。

图3 各因素交互作用的响应面及等高线图Figure 3 Response surface and contour plots of interactive effects

2.2.3 工艺优化及实验验证 根据响应面分析，卵白蛋白肽的最佳酶解条件为酶解时间5.26 h，复合酶用量3 075 U/g，酶解温度50.7 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3.35∶25 (g/mL)。为方便操作，将最佳条件调整为酶解时间5 h，复合酶用量3 100 U/g，酶解温度50 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3.5∶25 (g/mL)。在此条件进行3组平行实验，实际测得的卵白蛋白肽ADH激活率为(22.71±0.15)%，与模型预测值22.72%相差不大，表明在该模型下得到的最佳工艺条件具有较高的可靠性，可以用于预测卵白蛋白肽的ADH激活率。

2.3 卵白蛋白肽的总抗氧化能力与水解度

按1.3.3方法测定工艺优化后的卵白蛋白肽总抗氧化能力，结果为(9.51±0.13) U/mL。总抗氧化能力在一定程度上可以代表样品的自由基清除能力[21]。卵白蛋白肽在底物质量浓度为120 mg/mL[即料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3∶25 (g/mL)]时的总抗氧化能力比同样底物质量浓度下骨胶原抗氧化多肽的总抗氧化能力[(8.34±0.23) U/mL][22]高，因此卵白蛋白肽具备一定的抗氧化能力，能够清除人体内的自由基，减轻由乙醇引起的自由基大量累积，减少饮酒对身体的损害[23]。

按1.3.4方法测定工艺优化后卵白蛋白肽的水解度，结果为(29.28±0.16)%，与黑豆醒酒多肽的水解度(27.31±0.45)%相近[24]，说明酶解工艺较为理想。

2.4 卵白蛋白肽粉的分子量与氨基酸分布情况

由表4可知，在最佳酶解工艺条件下制备的卵白蛋白肽粉末中，总游离氨基酸含量达到了62.483%，丙氨酸(3.863 3%)，亮氨酸(5.764 7%)含量较为丰富，有助于人体稳定生成辅酶NAD+，降低体内乙醇的浓度。谷氨酸含量最高(9.554 3%)，有助于减轻醉酒症状。由表5可知，卵白蛋白肽88.77%的成分相对分子质量在1 000 Da以下，具有吸收快，耗能低，利用率高的特点。综上，酶解制备得到的卵白蛋白肽其相对分子质量小，便于吸收，且具有较强的生物活性。

表4 卵白蛋白肽粉的氨基酸组成情况Table 4 Amino acid composition of ovalbumin peptide g/100 g

表5 卵白蛋白肽相对分子质量的分布情况Table 5 Distribution of relative molecular weight of ovalbumin peptide

3 结论

卵白蛋白的最佳酶解条件为酶解时间5 h，复合酶用量3 100 U/g，酶解温度50 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸馏水)3.5∶25 (g/mL)，在此条件下得到的卵白蛋白肽ADH激活率为(22.71±0.15)%，水解度高，相对分子质量小，富含利于促乙醇代谢的氨基酸。卵白蛋白肽具备一定的抗氧化能力，能够清除人体内的自由基，后续可对卵白蛋白肽进行分离纯化，确定其肽段组成，并对促乙醇代谢能力与肽段间的联系进行研究。