高效液相色谱串联质谱法 测定沧州金丝小枣中多酚类物质

刘宪军，王晓明，来创业，刘本发，王 猛

（沧州市食品药品检验所，河北沧州 061001）

植物多酚又被称作植物单宁，是由复杂的酚类在植物体内经过次生代谢所产生的次生代谢产物，是存在于粮食类食品（大麦粒、高粱米、大豆等）、水果蔬菜类食品（茶叶、大葱、橘子等）或中草药植物（陈皮、石榴皮等）中的一种酚类物质，在植物体内的含量较高[1-3]。目前，食品中多酚类化合物的测定方法有多种，高锰酸钾滴定法、酒石酸亚铁分光光度法、化学发光法、原子吸收光谱法及高效液相色谱法[4-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

8030 Triple Quad液相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；ACQUITY BEH C18液相色谱柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），美国沃特世公司；高效液相色谱仪Waterse2695（二极管阵列检测器），美国沃特世公司；电子分析天平，瑞士梅特勒公司；真空干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司；恒温水浴振荡器，常州国华仪器有限公司；旋转蒸发仪，德国IKA公司；超纯制水机，美国默克密理博公司；酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；冷冻离心机，湖南湘智离心机仪器有限公司；甲醇、乙醇（色谱纯），美国赛默飞世尔科技有限公司；邻苯二酚标准物质（纯度均大于98%），美国默克公司；间苯三酚标准物质（纯度均大于98%），美国默克公司；其他试验检测用试剂均为分析纯，天津科密欧有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将沧州金丝小枣用水清洗后，去核、切片，在真空干燥箱中真空干燥（70 ℃，95 kPa），粉碎机粉碎，过60目筛。

准确称取经粉碎后的枣粉约2.0 g（精确至1 mg）样品放于250 mL的带塞锥形瓶中，用量筒加入40%乙醇溶液40 mL，在恒温水浴振荡器中60 ℃恒温水浴振摇60 min，反复振荡浸提两次，合并两次的提取液，在60 ℃温度下水浴旋转蒸发至少于5 mL，再用10 mL水溶解残渣。冷却至室温，倒入离心管中，然后放入离心机内，在离心温度为4 ℃的条件下，10 000 r/min离心5 min，然后用针管取上清液，将上清液过0.2 μm水系微孔滤膜，得试样液，待净化。

1.2.2 聚酰胺粉净化

将1.2.1得到的试样液在聚酰胺柱上样，控制流速不超过2 mL/min，用75%乙醇溶液淋洗，收集洗脱液。洗脱液60 ℃水浴下旋转蒸发至10 mL。冷却至室温，然后于离心机上4 ℃下10 000 r/min离心 5 min，并将上清液过0.2 μm水系微孔滤膜，进行液相色谱和液相色谱-质谱法分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm）；样品的进样量：5 μL；柱温箱温度设定： 30 ℃；二极管阵列检测器设置：检测波长278 nm；流动相的设定：甲醇+含0.1%甲酸的10 mmol乙酸铵水溶液（10∶90，V/V）；柱流速设定：0.3 mL/min。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；电离模式：负离子模式；干燥气流速：N2，12 L/min；锥孔电压：40 V；碰撞能量：30eV。

1.2.5 标液配制

标准储备液的配制：称取100 mg标准品，用20% 乙醇溶液定容至100 mL。标准使用液：用20%乙醇溶液稀释至1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L。

2 结果与分析

2.1 沧州金丝小枣中多酚类物质聚酰胺层析条件的优化

对不同浓度甲醇淋洗液（35%、55%、70%、90%）洗脱得到的多酚提取液进行检测，检测结果分别为0.21 mg/g、1.25 mg/g、14.6 mg/g和0.79 mg/g，多酚的得率在70%甲醇淋洗条件下最高，均可达到80%以上。因此，70%甲醇为聚酰胺柱层析的最佳淋洗条件。

2.2 高效液相色谱条件的选择及优化

2.2.1 色谱柱的选择

本试验采用在样品中加标的方式来选择不同规格的液相色谱柱（苯基液相色谱柱、BEH C18液相色谱柱、C8液相色谱柱），分别做3次平行试验。结果表明，苯基液相色谱柱对2种化合物不能完全分离，C8液相色谱柱峰型不好，BEH C18液相色谱柱柱则可达到基线全部分离，分离度明显优于其他两种色谱柱（见图1、图2、图3），本研究最终选择BEH C18柱为分 析柱。

图1 苯基液相色谱柱分离效果色谱图

图2 C8液相色谱柱分离效果色谱图

图3 BEH C18液相色谱柱分离效果色谱图

2.2.2 流动相的选择

经比较，考察了流动相中甲醇浓度（5%、10%）对提取物中多酚类物质的保留值和分离度的影响。由图4、图5可知，流动相在10%的甲醇浓度的条件下，使保留时间较短，峰形更尖锐对称，分离 较好。

图4 流动相为10%甲醇浓度条件的色谱图

图5 流动相为5%甲醇浓度条件的色谱图

2.2.3 进样量的选择

本试验分别对仪器（1 μL、2 μL、3 μL、4 μL及5 μL）不同的进样体积进行了考察。试验的结果显示随着仪器的进样体积的增加，检出限会降低，响应值也会相应的增加，但是过大的进样体积也会对色谱柱有影响，有可能会超过色谱柱的柱容量，特别是会加快色谱柱的老化报废，综合以上原因选择 2 μL的进样体积，满足检出限要求的同时也能有效地保护色谱柱。

2.2.4 柱温的比较优化

在相同的试验条件下，对不同的柱温（20 ℃、 30 ℃、40 ℃及50 ℃）进行考察。结果发现不同柱温箱温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃）各种条件下能满足峰分离，本着节能环保的理念，选择较常温相近的温度30 ℃作为柱温箱温度。

2.2.5 质谱条件的优化

配制浓度为1.0 μg/mL的邻二苯酚、间苯三酚的标准溶液，进行母离子扫描，确定电离方式和分子离子峰，在分别获得分子离子峰后，自动优化锥孔电压。经试验在负离子模式下邻苯二酚母离子为m/z109，[C6H6O2-H]-丰度最高，间苯三酚扫描的母离子为m/z125，[C6H6O3-H-H2O]-丰度最高，具体内容如表1所示。

表1 邻苯二酚和间苯三酚优化质谱参数

2.2.6 回归方程及检出限

用标准储备液配制邻苯二酚、间苯三酚浓度 分别为1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、 50.0 mg/L、100.0 mg/L及200.0 mg/L的标准溶液，在已确定的色谱条件下进行测定，峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，由表2可知，在1.0～200.0 mg/L的浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r也均大于0.998，以3倍信噪比（S/N）计算方法的检出限为 2.0 mg/kg。

表2 方法学实验结果

2.2.7 方法的回收率和精密度

通过向样品加标的方式做回收率和精密度试验，分别向样品中添加浓度50.0 mg/kg和200.0 mg/kg两个浓度的标准溶液后，按上述的方法进行前处理和上机测定，进行7次平行试验。在表3中可见，加标回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～4.27%，说明选定的方法满足检测要求。

表3 样品添加回收率和精密度试验

3 结论

采用聚酰胺层析柱净化，经C18柱分离后，在278 nm下对邻苯二酚及间苯三酚进行测定，同时串联质谱进行确证。方法线性相关系数r＞0.998， 检出限为2.0 mg/kg，在50.0 mg/kg、200.0 mg/kg浓度 添加水平下，回收率在83.4%～99.1%，RSD在2.87%～ 4.27%。该方法灵敏度高、重现性好、定性定量准确，适用沧州金丝小枣中邻苯二酚及间苯二酚的液相色谱法定量，质谱法辅助定性。