基于感官差异的会泽旱烟和师宗旱烟香气成分的HS-SPME-GC/MS对比分析研究

蒋昆明，李振杰，向能军，刘 泽，韦克毅，赵英良，毕玉波，李向珍，王 涛，邹聪明，刘志华

（1云南省烟草化学重点实验室/云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明 650231；2云南省烟草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000；3云南省烟草农业科学研究院，昆明 650021）

0 引言

旱烟又称土烟、叶子烟，属于晒烟的一种，直接通过晒制的工艺加工而成。会泽旱烟拥有独一无二的自然条件，不仅气候适宜，而且土壤中钾元素的含量较高，为紫色土，大部分属于微酸性的土壤[1-4]。因气候、土壤、栽培、调制技术、管理方法的不同，各地生产的旱烟品质差异较大。旱烟单位面积产量较低，但是其香味浓郁劲头足，燃烧性好，受到烟草工作者的青睐。深入研究烟叶的挥发性致香成分[5-8]，有助于卷烟生产工艺的优化及改进[9]，提升卷烟品质。目前，还未见关于旱烟的研究报道。

在云烟某规格产品中，会泽旱烟以薄片的形式添加到卷烟中，极大地改善了卷烟的感官体验。本研究通过固相微萃取-气相色谱/质谱法[10-16]对2种旱烟的挥发性成分进行分析，以期深入了解旱烟的内在品质，为产品升级提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

电子天平：BT224S型，灵敏度为0.1 mg，德国赛多利斯科学仪器有限公司。

固相微萃取-气相色谱/质谱联用仪：65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)固相微萃取纤维头，美国Supelco公司；8890 GC和5977B/MSD的气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Combi-PAL型多功能自动进样器（固相微萃取模块），瑞士CTC公司。

试验样品采用会泽旱烟烟叶和师宗旱烟烟叶，会泽旱烟采集于中国云南省曲靖市会泽县，师宗旱烟采集于中国云南省曲靖市师宗县。每种烟叶经过粉碎机粉碎后，过40目筛，所得的烟叶粉末用来进行各项分析。

1.2 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法

1.2.1 样品前处理 称取0.2 g样品于顶空瓶中，迅速取样密封后在多功能自动进样器中萃取。萃取头为粉色固相微萃取纤维头，萃取温度80℃，萃取时间20 min，萃取头转速250 r/min。

1.2.2 气相条件 色谱柱为DB-5MS型弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序设置为初始温度50℃，保持1.0 min，以5℃/min的升温速率升至260℃，保持10 min；进样口温度260℃；载气为氦气（纯度为99.999%）；流速1.0 mL/min；分流比10:1。

1.2.3 质谱条件 电子轰击电离源(EI)，电离能为70 eV，离子源温度为210℃，传输线温度为270℃，使用全扫描扫描方式，质量扫描范围为30～450 amu。

2 结果与分析

2.1 旱烟的感官质量评价

分别用会泽旱烟烟叶和师宗旱烟烟叶的烟丝、某市售卷烟的未加香的某叶组配方，以及分别将2种旱烟按10%的质量比例加入某市售卷烟叶组配方中，制成试验用卷烟。感官评价结果（表1）表明，与空白（某市售卷烟的未加香的叶组配方）卷烟相比，由会泽旱烟和师宗旱烟烟叶烟丝制成的卷烟香气质、香气量、杂气等下降，导致卷烟评分较低。而将会泽旱烟和师宗旱烟以10%的比例添加到某市售卷烟叶组配方中后，其评分要高于空白卷烟，而且2种卷烟都带有旱烟的香气风格，饱满度更好，坚果香更浓郁。添加了会泽旱烟的卷烟味道要比师宗旱烟更柔和一些，评分也略高。

表1 烟叶样品感官质量评价结果

2.2 HS-SPME-GC/MS法分析2种旱烟中的挥发性香气成分

基于感官质量评价结果，为了解旱烟的挥发性致香成分的差异，通过HS-SPME-GC/MS对2种旱烟进行对比分析。

2.2.1 HS-SPME-GC/MS富集效果的比较 为了考察HS-SPME-GC/MS方法的富集效果，对比静态顶空[17-19]进样和HS-SPME-GC/MS进样。静态顶空进样是称取0.2 g烟叶样品放入顶空瓶中，预热20 min后，取0.5 mL气体进入GC-MS分析，与HS-SPME-GC/MS不同的是，静态顶空的方法没有经过萃取头富集的过程。结果发现静态顶空进样几乎没有峰，而HS-SPME-GC/MS进样化合物的峰较多，富集效果显著，要优于静态顶空的方法。因此，选择HS-SPME-GC/MS法对2种旱烟的香气成分进行分析。

2.2.2 HS-SPME-GC/MS条件的优化 由于固相微萃取具有富集挥发性成分的效果，而且十分灵敏，萃取头种类、萃取时间和萃取温度的不同都会对结果产生很大的影响，因此需要对固相微萃取的使用条件进行筛选，通过筛选获得的最优条件进行样品测试，以得到最优的结果。本研究通过比较HS-SPME-GC-MS分析检测方法，在不同条件下检出的挥发性成分峰面积，对萃取头、萃取样品量、萃取时间和萃取温度的条件进行筛选及优化。

2.2.3 萃取头的选择 萃取头有多种纤维涂层材料，而涂层材料的种类决定了不同物质的富集效果，又影响着化合物在机器的响应强度，因此萃取头是固相微萃取技术的核心。萃取头也是根据相似相溶原理实现对不同物质的富集，对于不同类型的物质，需要选择不同的萃取头。因此，对不同涂层材料和涂层厚度的萃取头进行了筛选。

对6种萃取头（表2）进行了筛选，黄色和红色的萃取头涂层材料与纤维材料一致，但是红色的萃取头涂层材料厚度更厚，其检出的峰面积更大。而蓝色和粉色的萃取头纤维材料不同，Stable Flex纤维材料检测到的挥发性成分峰面积比石英玻璃纤维材料的大。另外，二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取头相比，二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取出来的成分略少于聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯。聚丙烯酸酯的萃取头萃取获得的挥发性成分也较少（图1）。从萃取效果看，聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯的粉色萃取头检测到的挥发性成分的总峰面积最大，分析样品效果较好。因此选用65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯的粉色萃取头进行后续试验。

图1 6种萃取头的筛选

表2 不同萃取头的产品信息表

2.2.4 样品量的选择 样品量会对固相微萃取的化合物的分离效果产生影响，样品量太少，色谱峰的数量少，强度低，在样品中含量低的挥发性成分将无法被检测到；样品量太多，会导致检出化合物之间的分离度降低，峰型变差。选择会泽旱烟作为样品，分析不同样品量对检测结果的影响。图2结果表明，随着样品量的增加，会泽旱烟烟叶挥发性化合物总峰面积增大，当样品量为0.2 g时总峰面积趋于稳定。说明样品量大于0.2 g后萃取头的萃取量趋于饱和，检出的挥发性化合物的总峰面积不再增加。因此，选择0.2 g样品量。

图2 样品量的筛选

2.2.5 萃取温度的筛选 萃取温度能直接影响挥发性化合物的吸附及富集效果，萃取温度过低时，萃取头吸附达到平衡所需的时间较长，所吸附的挥发性化合物的种类和含量都较少；温度升高时，挥发性化合物的运动加快，扩散率增加，利于吸附，能缩短平衡时间；但温度过高时，烟草中的羰基化合物会与氨基化合物发生美拉德反应，生成新的物质，从而影响定性分析。

为分析萃取温度对烟草中挥发性成分的影响，比较会泽旱烟在40、50、60、70、80、90、100℃不同温度下的峰面积总和。图3结果表明，烟叶中挥发性化合物的总峰面积随萃取温度的升高逐渐增加，当萃取温度达到80℃后，总峰面积基本趋于稳定。因此选择萃取温度为80℃。

图3 萃取温度的筛选

2.2.6 萃取时间的筛选 萃取时间对萃取物质的种类和强度也有着较大的影响。萃取时间较短时，物质尚未达到吸附平衡，萃取不完全，使被检出的化合物种类少，强度低。吸附时间过长时，会增加前处理的时间，降低效率。

选择会泽旱烟作为样品，分析不同萃取时间对检测结果的影响。图4结果表明，烟叶中挥发性化合物的总峰面积随萃取时间的增加而增大，但是变化不大，为了提高测试效率，选择20 min为萃取时间。

图4 萃取时间的筛选

2.2.7 实际样品分析结果 分别取会泽旱烟和师宗旱烟2种烟叶样品，通过HS-SPME-GC/MS法，测定挥发性香气成分，其总离子流图见图5，会泽旱烟与师宗旱烟的挥发性成分差异不大。

图5 旱烟的总离子流图

如表3所示，会泽旱烟检出挥发性成分为66种，其中醇类11种、醛类3种、酸类7种、酯类6种、酮类14种、碱类10种、烷烃10种、其他5种；师宗旱烟检出挥发性成分为62种，其中醇类7种、醛类4种、酸类3种、酯类3种、酮类20种、碱类11种、烷烃9种、其他5种。2种旱烟在挥发性成分组成及比例具有一定的特征性，表现出烟碱及新植二烯含量高的特点，2种物质占总挥发性成分的80%以上。2种旱烟在主要成分的化含量上差异不大，但是在微量挥发性成分上还是存在较大的差异，说明不同产地的旱烟还是具有一定的差别。

表3 旱烟烟叶样品中香气成分的相对百分含量

会泽旱烟的挥发性致香物质中，醇类物质主要为正丁醇，醛类物质主要为苯乙醛，酸类物质主要为乙酸，酯类物质主要为二氢猕猴桃内酯，酮类物质主要为植酮，碱类物质主要为烟碱，烷烃物质主要为新植二烯，其他物质主要为壬基琥珀酸酐。

续表3

续表3

师宗旱烟的挥发性致香物质中，醇类物质主要为植物醇，醛类物质主要为苯二十烷醛，酸类物质主要为乙酸，酯类物质主要为二氢猕猴桃内酯，酮类物质主要为植酮，碱类物质主要为烟碱，烷烃物质主要为新植二烯，其他物质主要为3-(4,8,12-三甲基十三烷基)呋喃。

会泽旱烟和师宗旱烟烟叶香气成分相对含量分析结果（表4）表明，2种旱烟主要的差异在于碱类、醇类及酸类物质总含量上。会泽旱烟在这些成分上的含量明显要比师宗旱烟更均衡一些，这有可能是会泽旱烟感官质量评价优于师宗的旱烟的原因。而2种旱烟碱类物质的含量较高，尤其是烟碱含量较高，这有可能是导致旱烟劲头较足的主要原因。

表4 旱烟中不同类型的挥发性香气成分的百分含量 %

3 讨论与结论

随着分子印迹聚合物、离子液体、各种碳纳米材料、无机纳米材料、金属有机框架化合物等材料的蓬勃发展，越来越多的新型材料被用于萃取头的材料[20-21]，极大地促进了HS-SPME-GC/MS技术的发展。尤其现代分析技术在保证结果可靠的基础上，对分析效率的要求越来越高，HS-SPME-GC/MS技术正好满足了这种需求，HS-SPME-GC/MS技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体，极大简化了样品的前处理过程，大大提高了测样的效率，因此，SPME技术目前被广泛应用于样品的挥发性和半挥发性成分的测定[22-24]。Lisanti等[25]建立了一种HS-SPME-GC/MS方法，用来定量测定红酒薄荷香味中的9种萜类成分，并用于14种波尔多红葡萄酒中薄荷萜类成分的定量。Zhang等[26]运用HSSPME-GC/MS技术对‘英红9号’黑茶在堆积堆发酵过程中的挥发性成分进行了分析，通过对不同发酵时间的挥发性成分进行对比分析，推测α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、苯乙醇可能为黑茶中关键的3种香气成分，为‘英红9号’的工艺和质量改进提供了理论依据。Yang等[27]利用HS-SPME-GC/MS技术对40种苹果果皮中的挥发性成分进行了分析，共鉴定出78种挥发性化合物，其中8种挥发性化合物在所有苹果品种中普遍存在，且香气具有品种特异性，丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯以及己醛、(E)-2-己烯醛、正己醇、草蒿脑和α-法尼烯等挥发性化合物可作为未来苹果品种分类的依据。叶子等[28]采用HS-SPME-GC/MS的非靶向分析技术，对比了9个品种小米辣发酵前后的挥发性香气物质，并通过多元数据分析，进一步探究不同品种发酵小米辣的特征性香气物质。结果表明，酯类和萜烯类物质是小米辣的主要特征性香气成分，且经过发酵后其种类和含量均显著增加。

笔者基于感官评价的结果，通过HS-SPME-GC/MS技术，首次对2种旱烟中的挥发性成分进行了对比分析。感官质量评价表明，添加了旱烟的卷烟评分明显高于空白对照组，而会泽旱烟又优于师宗旱烟。基于感官评价结果研究了2种旱烟在挥发性致香成分上的差异，通过对萃取头、样品量、萃取温度、萃取时间的条件筛选，建立了检测旱烟中挥发性香气化学成分的HS-SPME-GC/MS方法。2种旱烟主要致香成分种类为碱类、烷烃和酮类，而醇类、醛类、酸类、酯类等含量较少，其特有气味与这些物质有密切联系。本研究结果可为旱烟的资源开发与利用提供一定的理论基础。