野生玫瑰多态性cpDNA和ITS引物的筛选与验证

许建军，马 燕，吴其超，王宝盛，臧德奎

(黄河下游国家林业局林业重点实验室，山东农业大学 林学院，山东 泰安 271018)

玫瑰()为蔷薇科(Rosaceae)著名的香料和观赏植物，玫瑰的野生种群(野生玫瑰)是观赏和食用玫瑰育种的重要种质。野生玫瑰除了具有极高观赏价值、经济价值以及重要的药用价值，它还作为一种优良的海岸防风固沙植物，对维持滨海生态环境具有重要意义，同时其独特的分布模式对研究植物区系具有重要作用。但是这个极具研究和开发利用价值的物种，由于其滨海自然分布特点的适生环境受经济开发利用的严重影响，早在1992年野生玫瑰就被作为国家二级珍稀濒危植物编入《中国植物红皮书》。目前分布区域逐年缩小，呈现片段化，甚至部分区域已经消失不见，急需得到保护。

叶绿体基因具有受到的选择压力小、单亲遗传、无重组等优点，是研究谱系地理学的理想标记，在种内和种间研究中应用较多。核基因ITS具有双亲遗传、引物通用性强、碱基变异速率快等优点，作为对cpDNA的完善和补充，其在谱系地理学研究中的应用也逐步增多。二者结合在个体和群体水平上对物种祖先群体的探讨、生物冰期避难所及冰期后物种重新扩散等多个方面取得了重大发现。例如，利用叶绿体序列和核基因ITS序列联合分析研究中国红豆杉、文冠果、舟山新木姜子等植物的谱系地理。

近年来，国内对于野生玫瑰的研究主要侧重于栽培品种的开发应用，对野生资源遗传多样性和保护利用逐渐涉及，然而针对野生玫瑰的谱系地理和系统发育的研究尚未开展。本研究以野生玫瑰8个种群的157个个体为试材，通过PCR扩增和PCR产物测序，从12对叶绿体基因组引物和4对核基因组ITS引物中筛选高多态性引物，分析了野生玫瑰种群的遗传多样性，并以此构建系统发育树，对所筛选引物进行有效性验证。为进一步研究濒危植物野生玫瑰的谱系地理和系统发育奠定基础，为该珍稀濒危物种的种群恢复及保护利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料采自野生玫瑰自然分布区烟台、威海、辽宁、吉林4个地区，采集生长良好、无病斑幼嫩叶片，用变色硅胶迅速脱水干燥，共8个野生种群的材料(表1)，带回实验室整理后，-20 ℃保存备用。

表1 野生玫瑰各种群的采样信息

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法(增加水浴时间至1h，调整氯仿异戊醇的抽提次数)提取野生玫瑰全基因组DNA。用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，拍照查看DNA的质量。同时用核酸蛋白检测仪检测DNA的浓度与纯度，按照仪器使用说明进行。最后将原液DNA稀释到40 ng·μL，放入冰箱-20 ℃环境下保存备用。

1.2.2 PCR扩增、测序及引物筛选

通过查阅文献，将已经发表的比较适合种内水平的12对cpDNA引物(psbA-trnH、trnL-trnF、trnS-trnG、accD-psal、ndhF-rpl32、rpl20-rps12、atpF-atpH、rpl16、rbcl、psbJ-petA、psbD-trnT、trnV-trnW)(表2)和4对核基因ITS序列引物(ITS1、ITS2、ITS4、ITS5)(表2)交由擎科生物有限公司合成。用上述引物对24个DNA样品进行扩增和测序，PCR反应体系25 μL，包括1.1×T3 Super PCR MIX 22 μL、50 ng·μL模板DNA 1 μL、10 μmol·LForward Primer和10 μmol·LReverse Primer各1 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，退火10 s(退火温度根据文献确定)，72 ℃延伸(延伸时间根据10 kb·s计算)，35个循环；72 ℃延伸2 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，筛选出条带清晰明亮、无杂带、仅一条特异性扩增的PCR扩增产物，送到北京六合华大基因有限公司纯化测序。

表2 cpDNA和ITS通用引物序列

将测序数据利用Chromas2.3软件对所得碱基序列和原始峰图进行查看、比对和人工校正，然后将处理好的测序数据导入DNAMan软件中，通过序列对比，记录包括碱基的插入、缺失、倒置和替换等变异位点。

分别求出每对引物序列对应样品的核苷酸多态性(Π)和核苷酸差异平均数(K)，以此来判断所选引物是否具有高变异率。

1.2.3 遗传多样性分析及系统发育树构建

通过Permut软件获得野生玫瑰总体遗传多样性(Ht)和种群内平均遗传多样性(Hs)；将调整好的测序数据分别输入到Notepad软件处理保存成fasta文件，导入launch DNASP6软件中，运行DNA Polymorphism程序获得各种群的单倍型多态性Hd，即各种群的遗传多样性。

将处理好的测序数据保存为mega格式的文件，输入MEGA7.0软件进行系统发育分析。首先运行Select Taxa and Groups程序对157个扩增序列进行8个种群分组，然后运行Compute Net Between Group Mean Distances程序计算8个种群间的遗传距离，最后利用Neighbor-Joining Tree程序进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳结果显示，DNA条带清晰无拖尾，点样孔无亮条，说明未产生DNA降解和含有杂质的现象；核酸蛋白检测仪检测结果表明，所提DNA浓度在1 542～3 880 ng·μL，/在1.7～1.9，/在1.8以上，均符合后续试验条件。

2.2 PCR扩增及引物筛选

PCR扩增结果显示，trnL-trnF、trnS-trnG、rpl20-rps12、rpl16、rbcl五对叶绿体引物和ITS1、ITS2两对核基因引物条带清晰、单一，可作为候选引物，其余7对叶绿体引物和2对核基因ITS引物扩增结果存在未出带、非特异性扩增的现象，不符合实验要求。测序数据结果显示，trnS-trnG引物序列和ITS2引物扩增产物序列中存在大量套峰；在通过DNAMAN软件序列比对后，发现rpl16引物扩增产物序列中无变异位点，不具有多态性；trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl、ITS1四对引物扩增产物序列中具有不同程度的变异位点(表3)，有较高的多态性，能够进行野生玫瑰遗传分化和谱系地理的研究。

表3 四对筛选序列在野生玫瑰群体中的变异位点分布

根据launch DNASP6软件DNA Polymorphism程序导出的核苷酸多态性(Π)、核苷酸差异平均数(K)，绘制柱状图(图1)进行比较。发现筛选出的3对变异丰富的cpDNA引物，按照扩增产物核苷酸多态性(Π)值由高到低依次为rpl20-rps12、trnL-trnF、rbcl；按照扩增产物核苷酸差异平均数(K)值高低依次为rpl20-rps12、rbcl、trnL-trnF。ITS1引物扩增产物核苷酸多态性(Π)值为0.17，核苷酸差异平均数(K)值为0.43。

图1 四对野生玫瑰引物扩增产物的Π值和K值

2.3 遗传多样性及系统发育树分析

利用Dna SPv6软件计算得到野生玫瑰整体遗传多样型较低，Ht=0.435，种群内平均遗传多样性(Hs)为0.343。单倍型多态性(Hd)数值范围结果所示：成山镇(CSZ)种群多态性最高，遗传多样性最高；吉林九沙坪(JSP)、烟台牟平高尔夫(GEF)、酒馆村(JGC)、石城岛(SCD)、威海大伟广场(DWGC)种群遗传多样性次之，吉林沙丘公园(SQGY)、辽宁庄河花园口(HYK)多态性最低，种群遗传多样性最低。

在0.177～0.733。各种群的单倍型多态性如图2

图2 八个种群内的单倍型多态性

基于3对叶绿体引物trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl扩增测序联合分析的结果，利用8个种群间的遗传距离构建野生玫瑰系统发育树(图3)。结果显示：野生玫瑰8个种群明显分为2大支，吉林沙丘公园(SQGY)种群、九沙坪(JSP)种群为一支；辽宁庄河花园口(HYK)种群、石城岛(SCD)种群、烟台牟平高尔夫(GEF)、酒馆村(JGC)、威海大伟广场(DWGC)、成山镇(CSZ)6个种群为另外一支。

横线上方数字代表遗传距离。

3 讨论与结论

实验表明，在已发表的叶绿体DNA通用引物中，较少的引物适用于野生玫瑰谱系地理研究，这可能与物种的不同有关。有待获得充足的野生玫瑰叶绿体基因组数据，寻找高多态性的片段，自主设计引物序列，更全面地用于野生玫瑰系统发育和谱系地理的研究。ITS(internal transcribed spacer)由内间隔转录区1、5.8S以及内间隔转录区2序列片段组成，总长度在660 bp左右，我们在野生玫瑰引物筛选实验的测序结果中发现，ITS1序列片段存在碱基突变与多态性位点，5.8S基因具有高度的保守性，序列没有差异变化，而ITS2序列片段存在大量的碱基重复与高级结构，无法进行正常的序列碱基读取，最终选取ITS1(长度在285 bp)作为核基因引物序列，适合研究野生玫瑰的谱系地理。

实验发现，野生玫瑰的种群变异率较低，意味着种群遗传多样性较低，这可能与叶绿体基因组自身进化速率以及变异率相对较低而导致遗传多样性较低；同时野生玫瑰成熟果实的种子在经过鸟类吞食消化以及长时间、长距离的飞行，即使能够传播也很难存活并生长成植株，加上有性生殖能力差的繁殖特点使得远距离种群间基因交流变得困难，造成种群遗传分化程度升高，遗传多样性降低；另外与野生玫瑰分布区域范围狭窄，相对集中，且呈片段化的分布特点有关，种群经过长时间的遗传漂变造成等位基因丢失，遗传多样性不断降低。

基于遗传距离构建的系统发育树的结果来看，8个野生玫瑰种群明显分为2支，种群间的亲缘关系与其地理位置的远近相关，地理距离较近的种群通常聚为一支，如烟台酒馆村(JGC)种群、高尔夫(GEF)种群、威海大伟广场(DWGC)种群以及成山镇 (CSZ)种群地理距离较近，显示其亲缘关系较近；吉林珲春九沙坪(JSP)种群、吉林沙丘公园(SQGY)种群和烟台、威海种群地理距离较远，限制了种子的传播，阻断了基因流，没有聚为一支，其亲缘关系较远。对于辽宁庄河市花园口(HYK)种群、石城岛(SCD)种群和烟台威海种群聚在一支的情况，冯立国等根据实验结果推测野生玫瑰起源于山东东部沿海，后向北发展演化形成辽宁南部种群；Jiang等通过保守DNA衍生多态性(CDDP)分子标记实验研究不同种源的野生玫瑰遗传分化，聚类分析将辽宁种群与烟台威海种群聚在一起，均与本实验得出的结论一致。同时在历史上辽东半岛与山东半岛同属胶辽古大陆，植物属于同一区系，在后来的燕山事件和地壳运动影响下，现今的渤海陆地开始下沉，海水进入，辽东半岛和山东半岛才逐渐分开，另外由于物种的演化和变异是一个久远漫长的过程，种群之间基因变异较小，故亲缘关系较近。

本研究共筛选出3对多态性较好的cpDNA引物(trnL-trnF、rpl20-rps12、rbcl)和1对核基因ITS引物(ITS1)，适用于研究野生玫瑰种内的遗传分化、系统发育和谱系地理结构，能够进一步探究濒危物种野生玫瑰的谱系地理。