胚挽救技术创造无核抗病葡萄新种质

刘可可，李莎莎，骆强伟，徐 炎，王跃进

（1西北农林科技大学园艺学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室/农业部西北地区园艺作物生物与种质创制重点实验室，陕西杨凌 712100；2新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200）

0 引言

葡萄(Vitis vinifera L.)是跨越世界南北广泛种植的重要经济果树[1]。据联合国FAO数据，截止到2019年世界葡萄种植总面积为693万hm2，生产量为7428万t；中国的葡萄种植面积为74.6万hm2，生产量为1437.2万t，鲜食葡萄产量达到了世界第一，种植面积达到了世界第二[2]。其广泛用途呈现在鲜食、酿酒、制干、制汁、制酱。现在生产上缺乏无核抗病优质的葡萄品种。所以，无核抗病葡萄新品种选育与性状探究是亟需研究内容。早期的常规杂交育种方式既耗时，子代无核率又低，仅有0%～15.9%[3-4]。1982年，Ramming通过胚挽救技术成功获得2株实生无核葡萄[5]。美国育种学家用胚挽救技术，证实后代无核率在85%以上[6]，育成的无 核 品 种 有‘Autumn Crisp’、‘Adora Seedless’、‘Melissa’等[7]。现在该技术被各国葡萄育种家广泛应用于无核葡萄育种工作中[8-13]。中国培育成功的无核葡萄品种有‘沪培1号’[14]、‘沪培2号’[15]、‘紫丰’[16]等。本课题组前期也对葡萄的无核性状进行了研究[17-19]。基于以往的研究成果，本试验利用中国野生葡萄的优势，加强抗病性状育种研究，以欧洲无核葡萄作母本，中国刺葡萄‘塘尾’(Vitis davidii Foex.cv.Tangwei)、‘雪峰’(Vitis davidii Foex.cv.Xuefeng)及山葡萄‘双优’(Vitis amurensis Rupr.cv.Shuangyou)和欧山杂种‘北醇’(Vitis vinifera L.× Vitis amurensis Rupr.)为父本，将抗病性基因融入到无核品种中，采用胚挽救技术来提高育种效率。利用无核标记SCF27-2000[20]以及课题组前期获得的无核探针GSLP1-569[21]、抗霜霉病探针S294-369、S382-615[22]、抗白粉病探针 OPY13-661[23]对杂种后代进行分子标记辅助选择，加快无核抗病葡萄的培育。为解决常规杂交育种效率低、无核品种不抗病、需要喷药防病等问题，选育出无核抗病新种质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年4月—2021年4月在西北农林科技大学葡萄种质资源圃、旱区作物逆境生物学国家重点实验室和新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所完成。父本为抗病性较强的山葡萄‘双优’，刺葡萄‘塘尾’、‘雪峰’，欧山杂种‘北醇’；母本均为欧洲无核葡萄品种。

1.2 主要仪器

葡萄专用杂交袋、尖头镊子(14 cm)、手术刀（23号）、解剖镜、一次性塑料培养皿(90 mm)、培养基(ER、E20A、MM3)，PCR 仪(BIO-RADPTC-0200)、核酸染料（北京全式金）、琼脂糖、电泳仪(Consort E844)、电泳缓冲液、超净工作台、凝胶成像系统等。

1.3 试验方法

1.3.1 大田杂交与胚挽救技术操作流程 在大田去雄时，选择健壮的树、健壮枝蔓、健壮结果母枝、健壮结果枝、健壮花序上健壮的花蕾进行去雄，去雄后喷水，并套上专用杂交袋。柱头表面溢出粘液时，选择晴朗无风的上午，8：00—10：00授粉，连授3天。后期子房膨大即授粉成功，否则进行补授。根据母本的授粉日期，适时采收杂交果实。杂交果穗取回后，剪下果粒置于网兜(10 cm×12 cm)冲洗2～6 h。在超净台用酒精(75%)处理30 s，无菌水冲洗3～5次，次氯酸钠(3%)处理20 min，无菌水冲洗3～5次。剥取胚珠接种于胚发育培养基中。胚珠暗培养8周后，剖取胚接种至胚萌发培养基。胚40天左右长大成苗，之后进行扩繁，炼苗，最终移栽到大田（图1）。参考田莉莉[24]统计发育胚的枚数和成苗数，计算胚发育率和成苗率，公式(1)～(2)。

图1 无核抗病葡萄胚挽救过程

1.3.2 取样时间对胚挽救影响试验‘火焰无核’ב北醇’组合于授粉后37～42天，每天取1次杂交幼果；‘京可晶’ב北醇’组合于授粉后34～44天，隔天取1次杂交幼果，比较不同取样时间对胚发育的影响。

1.3.3 不同培养基对胚发育影响试验 取‘美丽无核’自然授粉后40天、‘昆香无核’自然授粉后45天、‘红宝石无核’与‘赫什无核’自然授粉后60天的胚珠，分别接种于ER、MM3、E20A[25]培养基中。采用正交设计，进行3次生物学重复。比较不同培养基对胚发育结果的影响。

1.3.4 胚珠发育培养基中添加不同浓度多胺对胚挽救影响试验 取‘红宝石无核’ב塘尾’杂交后的胚珠接种，以7 g/L琼脂+60 g/L蔗糖+3 g/L活性炭+MM3为基础培养基，培养基内分别添加0、1、2、3、4、5 mmol/L的亚精胺、精胺和腐胺。采用正交设计，进行3次生物学重复。比较不同多胺，不同浓度对胚发育率和成苗率的影响。

1.3.5 杂交后代无核性状和抗病性状的早期鉴定 参考王跃进等[26]使用CTAB法提取DNA。使用无核标记GLSP1-569和SCF27-2000、抗霜霉病标记S382-615和S294-369以及抗白粉病标记OPY13-661进行检测，使用分子标记技术辅助选择杂种植株的性状。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0软件，对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 无核抗病葡萄胚挽救结果

共配置杂交组合15个（表1），获取杂交果实13038个，接种胚珠8572枚，胚发育数1338枚，得到234棵杂交苗，平均成苗率2.73%。其中组合‘红宝石无核’ב塘尾’杂交获得的发育胚和成苗数量最多，得到922枚发育胚和178株杂交子代，胚发育率为40.17%，成苗率为7.76%。‘双优’作父本的组合中，成苗率最高的是以‘无核白’作母本，为3.08%。‘北醇’为父本的组合中，成苗率最高的是以‘火焰无核’做母本，为1.98%。父本为‘塘尾’的杂交组合中，成苗率最高的是‘红宝石无核’做母本，为7.76%。

表1 无核抗病葡萄胚挽救结果

2.2 取样时间对胚发育率和萌发率的影响

如表2所示，‘火焰无核’ב北醇’在授粉后42天取样，杂交胚的发育率(11.37%)和萌发率(3.52%)达到最高；‘京可晶’ב北醇’在授粉后38天取样，杂交胚的发育率(4.3%)和萌发率(1.08%)达到最高。

表2 不同取样时期对胚挽救胚发育与成苗的影响

2.3 不同培养基对胚发育率的影响

将‘红宝石无核’、‘美丽无核’、‘昆香无核’与‘赫什无核’的胚珠分别接种于ER、MM3、E20A培养基上（表3），以这4个品种为母本进行胚挽救，结果表明，在E20A培养基上胚发育率最高，分别为14.33%、4.5%、6.1%、10.33%，胚发育率差异显著。

表3 不同培养基对胚发育与胚挽救成苗的效果

2.4 胚珠发育培养基中添加不同浓度多胺对发育胚数量和成苗数的影响

以MM3为基础胚发育培养基，添加不同多胺、不同浓度，取‘红宝石无核’ב塘尾’的胚珠接种，结果表明添加3 mmol/L腐胺对胚的发育和成苗率效果最优(55.83%、20%)（表4）。其次是添加1 mmol/L亚精胺对胚的发育和成苗率影响较高(50.37%、12.78%)。随着外源添加物质的浓度提升，成苗数量以及幼苗长势呈现一个下降的趋势（图2）。由此可见，在胚发育时期添加适量外源多胺对胚发育和成苗有较好的效果。

图2 MM3胚挽救胚珠发育培养基添加不同多胺处理的成苗与生长情况

表4 MM3胚珠发育培养基中添加不同浓度多胺对胚挽救成苗的影响结果

2.5 分子标记辅助选择鉴定

2.5.1 无核、抗病标记对杂交亲本的鉴定 对6个杂交亲本进行分子标记鉴定（图3），无核标记GSLP1-569和SCF27-2000的鉴定结果中，‘红宝石无核’、‘火焰无核’、‘昆香无核’均携带无核分子标记，GSLP1-569和SCF27-2000可用于母本为以上亲本的杂种无核性状的鉴定；抗霜霉病标记S382-615检测出‘塘尾’携带此标记，可用于父本为‘塘尾’的杂种鉴定。抗霜霉病标记 S294-369 检测出‘塘尾’、‘北醇’、‘雪峰’携带此标记，可用于检测父本为以上亲本的杂种鉴定。抗白粉病标记OPY13-661检测出‘塘尾’、‘北醇’携带此标记，因此可用于父本为‘塘尾’、‘北醇’的杂种鉴定。抗黑痘病标记OPSO3-1354没有检测出特异性条带。

图3 葡萄无核、抗霜霉病标记对杂交亲本的鉴定结果

2.5.2 无核、抗病标记对杂交后代的鉴定 不同分子标记对杂交后代的鉴定结果见（表5），对‘火焰无核’ב北醇’24个杂种子代的检测结果中，有7个株系同时携带抗霜霉病、抗白粉病、无核特异性条带，占比29.17%。对‘红宝石无核’ב塘尾’178个杂种子代检测结果中，有6个株系同时携带抗霜霉病和抗白粉病、无核特异性条带，占比3.37%。对‘火焰无核’ב昆香无核’18个杂种子代检测结果中，有5个株系同时携带2种无核标记特异性条带，后代无核株率为27.78%。对‘火焰无核’ב塘尾’和‘红宝石无核’ב雪峰’5个杂种子代检测结果中，这2个组合后代无核与抗白粉病株率为100.0%。‘火焰无核’ב塘尾’有3个株系同时携带无核抗霜霉病特异性条带，后代抗霜霉病株率为75.0%。

表5 不同分子标记对杂交后代鉴定结果

3 讨论与结论

第一个无核葡萄品种‘梅尔’，是美国的Meier于1922年得到(Merer Everbearing)[27]。当时，一个新品种的问世用了10～20年的时间选育[3-4,30-31]，选育无核后代的效率有待提高。胚挽救技术最早应用在果树研究上的是Tukey[32]对樱桃离体胚的培养。胚挽救技术的问世，使无核葡萄间可以进行杂交[33-34]，至少节省5年时间[6]。Burger[35]通过这种方式，培育出2632株杂种后代，选育出的F1代无核率在55%～92%之间，提升了后代无核效率。在胚挽救离体培养过程中，有许多关键因素决定胚发育率及成苗率，如亲本的选择、培养基的选择、取样时间以及个人操作技术都会影响到挽救的成败。

葡萄的病害危害整个生长周期，一直得不到有效的解决办法，快速培育出无核、抗病的品种迫在眉睫。近年来，利用胚挽救技术培育无核抗病葡萄已成为食用葡萄育种的目标[36-37]。引入无核抗病性状，可从根本上防治霜霉病、根瘤蚜等病害。国外最先用无核葡萄与抗病圆叶葡萄杂交，获得‘C41-5’抗病无核新株系[3]。经鉴定中国的野生葡萄有很好的抗病性，且与欧洲葡萄亲和性更好[38-39]。通过胚挽救技术可以使中国野生葡萄抗病基因与欧洲葡萄无核基因有效地融合。

MEJIA等[20]获得无核探针SCF27-2000并用其对杂交子代进行检测，GSLP1-569的获得也为无核性状的选择奠定了基础，张艳艳等[22]使用中国野生葡萄‘白河35-1’成功获得抗霜霉病探针S294-369、S382-615；张剑侠等[23]获得抗白粉病探针OPY13-661，并对后代进行了辅助选择。分子标记在育种上的应用，更是加速了对子代性状的鉴定，可以节省大量人力物力[20-22,40]。前人针对单一的性状进行较为单一的分子标记辅助选择，而本试验用多种分子标记辅助选择杂交后代的无核性与抗病性。

利用中国野生葡萄与无核欧洲葡萄品种杂交，创造无核抗病的新植株，从根本上提高杂种的抗病性，减少了农药使用导致的农药残留和环境污染，让人们消费优质的无核抗病新品种果实。在以后的无核抗病胚挽救育种中，可以参考本研究中‘红宝石无核’与‘火焰无核’做母本，‘塘尾’与‘北醇’做父本杂交，可以获得较多的杂种后代。以‘京可晶’为母本授粉后38天取样较好，以‘火焰无核’为母本授粉后42天取样较佳。以MM3为基础培养基，外源添加3 mmol/L的腐胺，可以获得较高的胚发育率与成苗率。分子标记辅助选择鉴定225株杂种后代，筛选出16株既携带无核性状又携带抗霜霉病与抗白粉病特异条带，这些无核抗病的新种质是今后重点观察与培育的种质资源。本研究为葡萄无核抗病胚挽救育种提供了技术依据与新种质。