采用HPLC-PED法测定硫酸小诺米星及其注射液有关物质和组分的探讨

赵敬丹?蒋孟虹?刘浩

摘要：目的 新建硫酸小诺米星及其注射液有关物质和组分检查的HPLC-脉冲安培电化学检测（PED）法，并探讨其用于评价硫酸小诺米星及其注射液质量的合理性。方法 色谱柱为Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）；以1.5%三氟醋酸溶液（用50%氢氧化钠溶液调节pH值至2.6）-乙腈（98：2， V/V）为流动相，脉冲安培电化学检测器检测，金电极为工作电极，四电位波形工作模式，柱后加0.5 mol/L NaOH溶液，流速0.4 mL/min。结果 新建的电化学检测法可实现小诺米星相关杂质和小诺米星组分的准确定量，灵敏度是蒸发光散射检测法（ELSD）的近40倍，对于国产硫酸小诺米星及其注射液质量控制具有重要作用。结论 HPLC-PED法灵敏度高，重复性好，可替代或和现有蒸发光散射法联合作为硫酸小诺米星及其注射液有关物质和组分检查的分析方法。

关键词：小诺米星；庆大霉素C1a；杂质；ELSD；脉冲安培检测

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Detection of the related substances and component in micronomicin sulfate and its injection by HPLC-PED

Zhao Jing-dan， Jiang Meng-hong， and Liu Hao

（Shanghai Institute for Food and Drug Control， Shanghai 201203）

Abstract Objective To establish an HPLC method with pulsed electrochemical detector （PED） for the analysis of micronomicin sulfate and its injection， and evaluate its rationality. Methods A Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）column was used， and the mobile phase was 1.5% trifluoroacetic acid solution （the pH of the aqueous solution was adjusted to 2.6 with 50% NaOH solution）-acetonitrile（98∶2）at a flow rate of 1.0 mL/min. A pulsed electrochemical detector was used. The electrochemical cell consisted of a working electrode，a pH-Ag/AgCl reference electrode， and a titanium counter electrode. The working electrode was a gold electrode （diameter 3 mm） and a quadruple-potential waveform was selected as the detection waveform. The 0.5 mol/L NaOH solution was added post column at a flow rate of 0.4 mL/min. Results The method can be used for comprehensive analysis of the impurity profile of micronomicin and its injection， and also the determination of the accurate amount of component of micronomicin. The sensitivity is nearly 40 times higher than that of ELSD， and thus it will play an important role in routine quality control. Conclusion The PED method was proved to be sensitive and repeatable， and can replace the ELSD method as a new method to detect related substances and component of micronomicin.

Key words Micronomicin; Gentamicin C1a; Impurity; ELSD; Pulsed amperometric detector

小諾米星（micronomicin）是小单胞菌及其变异株所产生的一种氨基糖苷类抗生素。小诺米星生物发酵提取混合液中含有C1a与C2b两种主要组分，其中C2b为小诺米星[1]。由于为微生物发酵产生，硫酸小诺米星原料中除了庆大霉素C1a外，还含有许多其他成分，C2b的纯度直接影响硫酸小诺米星的成品质量。因此，建立一种可有效反映产品质量的分析方法对于监测药品的质量，提升临床用药的安全性非常重要。

目前，文献报道的小诺米星组分和有关物质测定的方法主要有王明娟等开发的HPLC-ELSD法[2]以及袁耀佐等开发的HPLC-PED法[3]。ELSD法即2020年版《中国药典》中收录的用于测定小诺米星组分的方法，该方法操作简单，分析速度快，在小诺米星质量控制中发挥了重要作用。但是，蒸发光散射法检测灵敏度较低，不适合作为现代分析方法用于小诺米星及其有关物质的测定；PED法采用三氟乙酸、五氟丙酸和乙腈为流动相，电化学检测，并且对主要的杂质进行了质谱鉴定。该方法重点关注杂质的分离和初步鉴定，对于庆大霉素C1a等相关物质的定量方式未进行系统地研究。但是，相比于ELSD法，PED法在灵敏度和方法的先进性方面具有明显的优势，并且浓度与响应值呈线性关系被欧美药典广泛收载。近年来，江苏省食品药品监督检验研究院在硫酸新霉素[4]、硫酸核糖霉素[5]、硫酸依替米星[6]等氨基糖苷类抗生素PED法的开发方面进行了深入的研究，且硫酸依替米星成为首个采用PED法录入《中国药典》的氨基糖苷类品种。PED法以及其他灵敏度和专属性高的方法有望作为ELSD法的可替代方法被录入《中国药典》。

鉴于目前缺乏对于硫酸小诺米星及其制剂有关物质和组分共同定量测定的法定方法，且为了提高方法的普及性。本研究在《美国药典》庆大霉素原料组分测定方法的基础上，对流动相进行优化，采用对电极损伤小的四电位波形为检测电位，采用三氟乙酸-乙腈为流动相系统，避免了较为昂贵的五氟丙酸或七氟丁酸的使用，建立了可同时用于硫酸小诺米星及其制剂有关物质和组分测定的HPLC-PED法，同时通过对庆大霉素C1a对照品的标化，对比了外标法、峰面积归一化法和主成分自身对照法对有关物质测定结果的影响，为提高定量结果的准确性提供了依据。该方法操作简便，灵敏度高，实现小诺米星与其主要杂质之间的良好分离，可作为小诺米星有关物质及组分检测的常规方法。

1 仪器与试药

Thermo ICS-5000+型离子色谱仪，配备脉冲安培电化学检测器（3 mm金电极）；Agilent 1100型高效液相色谱仪， 配备SEDEX90型蒸发光检测器；Sartorius CPA225D型电子天平；Millipore纯水系统。

硫酸小诺米星原料（江西制药有限责任公司，批号：A和B）；硫酸庆大霉素标准品（中国食品药品检定研究院，批号：130326-201716，含量：637 U/mg）；硫酸小诺米星标准品（中国食品药品检定研究院，批号：130342-201404，含量：以小诺米星计51.8%）；庆大霉素C1a对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130515-201603）；西索米星对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130635-201301，含量：56.0%）；硫酸小诺米星注射液来源于3个企业（河南科伦药业有限公司，批号：C；云南大理药业股份有限公司，批号：D；江西制药有限责任公司，批号：E）；三氟醋酸，甲醇，乙腈和50%氢氧化钠溶液均购自Merck公司，均为色谱纯，水为Millipore超纯水。

2 实验方法

2.1 庆大霉素C1a对照品的标化

2.1.1 色谱系统

色谱柱：Welch Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2 mol/L三氟醋酸溶液-甲醇（98：2）；流速：0.5 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10 μL；蒸发光漂移管温度50℃，载气流量5.0 bar；增益值4。

2.1.2 溶液的配制

系统适用性溶液：取庆大霉素标准品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含庆大霉素总C组分2.5 mg/mL的溶液。

对照品溶液：分别取西索米星对照品和小诺米星标准品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成约含西索米星和小诺米星各25、50和100 μg/mL的溶液。

供试品溶液：取庆大霉素C1a对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含庆大霉素C1a 2.5 mg/mL的溶液。

2.2 小诺米星HPLC-PED法

2.2.1 色谱系统

色谱柱：Welch Ultimate LP-C18（3.9 mm×300 mm，5 μm）；流動相：1.5%三氟醋酸溶液（用50%氢氧化钠溶液调节pH值至2.6）-乙腈（98：2）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；积分脉冲安培电化学检测器检测；检测电极：金电极（3 mm），参比电极：Ag/AgCl复合电极，钛合金对电极；四波形电位（表1）；柱后碱溶液：50%氢氧化钠溶液（1→25），流速：0.4 mL/min；进样体积：25 μL。

2.2.2 溶液的配制

（1） 有关物质

系统适用性溶液1：取小诺米星标准品适量，加流动相溶解并稀释制成约含0.24 mg/mL的溶液。

系统适用性溶液2：取庆大霉素标准品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含庆大霉素总C组分0.24 mg/mL的溶液。

对照品溶液：分别取庆大霉素C1a对照品和小诺米星标准品各适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成约含庆大霉素C1a和小诺米星各1、2.5、5、10和25 μg/mL的系列线性溶液。

硫酸小诺米星原料供试品溶液：取硫酸小诺米星原料适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.24 mg/mL的溶液。

硫酸小诺米星注射液供试品溶液：精密量取硫酸小诺米星注射液适量，按标示量加流动相稀释制成约含小诺米星0.24 mg/mL的溶液。

自身对照溶液：精密量取上述供试品溶液适量，加流动相定量稀释制成约含小诺米星2.4 μg/mL的溶液。

（2） 小诺米星组分

硫酸小诺米星原料供试品溶液：取硫酸小诺米星原料适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.1 mg/mL的溶液。

硫酸小诺米星注射液供试品溶液：精密量取硫酸小诺米星注射液适量，按标示量加流动相稀释制成约含小诺米星0.1 mg/mL的溶液。

对照品溶液：取硫酸小诺米星标准品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.1 mg/mL的溶液。

3 方法学验证

3.1 方法专属性

分别取“2.1.2”和“2.2.2”项下的系统适用性溶液，进样分析，记录色谱图（图1～3）；取小诺米星原料和注射液，分别经酸、碱、氧化、光照和加热破坏，照“2.2.1”项下的色谱系统，进样分析。结果表明：庆大霉素C1a峰和西索米星峰之间，庆大霉素C2峰和小诺米星峰之间，小诺米星峰和庆大霉素C2a峰之间分离均良好，小诺米星主要降解杂质均表现为弱保留，不干扰各相关已知杂质之间的测定，方法专属性良好。

3.2 线性与范围

取硫酸小诺米星标准品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.24 mg/mL的溶液，作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液适量，加流动相稀释制成浓度分别为0.24、0.48、0.96、1.2、2.4、12、24、48和120 μg/mL的系列线性溶液。分别取上述溶液25 μL，注入色谱仪，记录色谱图。以小诺米星峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程为：A=2.3340C+3.3326，r=0.9997。结果显示，小诺米星浓度在0.24～120 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.3 检测限和定量限

以信噪比S/N=3计，小诺米星的检测限约为2 ng；以信噪比S/N=10计，小诺米星的定量限约为6 ng。

3.4 重复性

取硫酸小诺米星原料适量，共6份，精密稱定，分别用流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.24 mg/mL

的溶液，照“2.2.1”项下的色谱条件，测定其有关物质，庆大霉素C1a的RSD为0.7%，其他单个最大杂质的RSD为0.4%，其他杂质总量的RSD为1.0%。结果表明：分析方法重复性良好。

3.5 溶液的稳定性

取硫酸小诺米星原料适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成约含小诺米星0.24 mg/mL的溶液，于室温放置0、1.5、3、5、7、8.5、10和12 h后，照“2.2.1”项下的色谱条件，测定其有关物质。庆大霉素C1a、其他单个最大杂质及其他杂质总量的RSD均小于1.2%。结果表明：硫酸小诺米星溶液在室温放置12 h内较为稳定。

3.6 耐用性

考察3根不同品牌的C18色谱柱的分离情况，分别为Welch Ultimate LP-C18柱（3.9 mm×300 mm，5 μm）、Thermo Aminoglycoside（Beta）柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Diamonsil Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），各杂质峰均能和小诺米星主峰及其他杂质得到有效分离，说明本方法的耐用性较好。

4 相对响应因子的测定

4.1 庆大霉素C1a对照品的纯度

采用西索米星峰和小诺米星的线性回归方程分别计算庆大霉素C1a色谱图中西索米星和小诺米星的含量，其他杂质峰按西索米星线性回归方程计算，得庆大霉素C1a对照品的纯度为95.5%（n=6）。

4.2 庆大霉素C1a相对响应因子

取“2.2.2”项下的对照品溶液，进样分析，记录色谱图，分别绘制标准曲线，以庆大霉素C1a回归直线斜率与小诺米星回归直线斜率的比值计算相对响应因子。结果显示，庆大霉素C1a相对响应因子为1.03，表明庆大霉素C1a和小诺米星在电化学色谱系统中响应基本一致。

5 样品测定

采用PED法对2件硫酸小诺米星原料、硫酸小诺米星标准品以及3件硫酸小诺米星注射液按“2.2.1”项下色谱条件进行有关物质检查和组分分析，结果见表2，典型色谱图见图4。

6 讨论

6.1 分离条件优化

因氨基糖苷类抗生素极性大，在常规C18柱上不保留，现有各国法典中收录的氨基糖苷类各品种检测方法均采用在流动相中添加离子对试剂，如三氟乙酸、五氟丙酸或七氟丁酸等，改善色谱保留。研究过程发现：随流动相中三氟乙酸、五氟丙酸浓度的增加，分离改善，但保留时间延长；在一定范围内（pH值2.0～4.0）调节流动相的pH值，可以改善色谱分离，色谱保留同样增加；在流动相中添加乙腈，可缩短分析时间，但部分杂质对流动相中乙腈的比例比较敏感。

随着市场上不同种类色谱填料的出现，给色谱条件的优化提供了便利，同时提高了试验方法的重现性，试验证实，本文采用的色谱填料在流动相中不添加五氟丙酸时，经色谱条件的优化，可以实现小诺米星及其相关杂质的良好分离。根据主峰的保留时间、各已知杂质峰之间的分离度、主峰与相邻峰之间的分离度等，最终确定了流动相系统：1.5%三氟醋酸溶液（用50%氢氧化钠溶液调节pH值至2.6）-乙腈（98：2，V/V）。

6.2 有关物质定量方式的选择

分别以峰面积归一化法、外标法和主成分自身对照法对2件硫酸小诺米星原料和硫酸小诺米星标准品进行了有关物质测定（表3），以确定最佳定量方式。

由上述结果知，3种定量方法对庆大霉素C1a、其他单个最大杂质和其他总杂质的测定结果未见显著影响。因此，可采用主成分自身对照法进行定量。

6.3 HPLC-ELSD法与HPLC-PED法对小诺米星组分测定结果的比较

对比了新建的HPLC-PED法和现有HPLC-ELSD法2件硫酸小诺米星原料和硫酸小诺米星标准品中小诺米星组分的测定结果（表4）。

由上述结果知，HPLC-PED法定量测定结果均比HPLC-ELSD法低约2%。分析原因可能与不同原理仪器的定量方式不同所致，后续可根据大量样品的统计数据确定采用PED法进行定量时是否需要调整限度。

7 结论

本文建立的HPLC-PED法操作简便，灵敏度高，可实现小诺米星与其主要杂质之间的良好分离，可作为小诺米星有关物质及组分检测的常规方法。

参 考 文 献

郭慧玲， 胡志方. 大孔树脂精制硫酸小诺霉素的工艺研究[J]. 江西医药， 2003， 38（6）： 455-456.

王明娟， 胡昌勤， 金少鸿. 采用HPLC-ELSD法分析小诺霉素及其有关物质[J]. 药物分析杂志， 2002， 22（3）： 205-208.

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史孙亮， 侯玉荣， 耿悦， 等. 高效液相色谱-脉冲安培检测法测定硫酸核糖霉素含量及有关物质[J]. 中国药学杂志， 2019， 54（4）： 321-326.

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收稿日期：2021-07-20

基金项目：2021年上海市药品监督管理局研究课题（No. LX-2021-08）

作者简介：赵敬丹，女，生于1984年，主管药师，主要从事抗生素的质量分析与研究，E-mail： dannyzhaoj@163.com