不均一性核糖核蛋白F抑制流感病毒复制机理探究

马慧玲 任俊铮 赵梦娇 姜波 薛瑞雪 王敏 汪洋 陈静

摘要：流感病毒在宿主细胞核内复制时会存在大量的病毒RNA，在这个过程中细胞核内会存在相关的蛋白来参与流感病毒复制。为了探讨不均一性核糖蛋白F（hnRNP）抑制流感病毒复制的机理，研究在细胞内过表达hnRNP F蛋白，结果出现流感病毒复制被抑制的现象，免疫共沉淀和间接免疫荧光试验进一步证实了hnRNP F通过与流感病毒RNA结合抑制核酸出核，发挥抑制流感病毒复制作用。说明hnRNP F蛋白可能通过与流感病毒的RNA结合而阻止核酸出核来发挥抑制流感病毒的作用。

关键词：免疫共沉淀;hnRNP F蛋白;RNA;流感病毒

中图分类号：S852.65文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.003

Heterogeneous Ribonucleoprotein F Inhibit Replication of Influenza Virus and Study of Molecular Mechanism

MA Huiling 1，REN Junzheng2，ZHAO Mengjiao3，JIANG Bo4，XUE Ruixue1，WANG Min1，WANG Yang1，CHEN Jing1

（l.Shandong Provincial Center for Animal Control and Prevention，Jinan 250100，China;2.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，China;3.Yantai Centre for Animal Control and Prevention，Yantai Shandong 264003，China;4.Rongcheng City Li Island Animal Husbandry and Veterinary Station，Weihai Shandong 264300，China）

Abstract：Influenza virus is an RNA virus that replicates in the nucleus. During the replication process，a lot of virus RNA exists in the nucleus. In the process of influenza virus replication，there will be numbers of host proteins in the nucleus involved in virus replication. This study found that overexpressed hnRNP F protein in cells could inhibit the replication of influenza virus. Further，co-immunoprecipitation and indirect immunofluorescenc e assay demonstrated that hnRNP F could inhibit replication of influenza virus by interacting with influenza virus RNA to inhibit virus RNA out of nucleus.

Keywords：co-immunoprecipitation，hnRNP F protein，RNA;influenza virus

0引言

流感病毒（Influenza virus）属于正黏病毒科流感病毒属，病毒结构由内而外分为核芯、基质蛋白和囊膜3个部分，基因组包含8个分节段的单股负链RNA（ss- RNA）。流感病毒的基因组RNA（vRNA）与核蛋白（NP）结合，并与RNA聚合酶复合体缠绕成致密的核糖核蛋白复合体（RNPs），以异源三聚复合体的形式存在于感染宿主的细胞核内，主要参与病毒RNA的合成[1-2]。流感病毒感染的宿主范围十分广泛，包括其他哺乳动物、禽类、鸟类等。

不均一性核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是细胞核内的一类RNA结合蛋白，包括约30个高丰度表达的成员[3-5]，这类蛋白可与新合成的不均一性RNAs（hnRNAs/pre-mRNAs）的内含子区域结合来协助完成内含子的剪切，并在mRNA从细胞核转运至细胞质的过程中结合mRNA来稳定mRNA结构[6-8]。在该蛋白家族中，有研究证明核内蛋白hnRNP K、hnRNP A2/B1均能够参与流感病毒的复制过程[9-10]，而hnRNP F蛋白是hnRNPs家族蛋白中一员，在细胞核内含量丰富，参与mRNA前体的剪切、加工和运输等功能[11-12]。目前，尚未见有流感病毒与hnRNP F相互作用研究的相关报道。本研究通过免疫共沉淀试验和激光共聚焦试验研究了hnRNP F蛋白对流感病毒的作用，以期为抗流感病毒药物研发提供思路。

1材料

毒株A/WSN/1933（H1N1）、293T细胞系、犬肾上皮细胞系MDCK和人肺癌细胞系A549，由本试验室保存;兔抗β-actin、Flag、hnRNP F多抗和鼠抗A型流感病毒NP、M1、M2、PB1、PB2、PA多抗，均购自Thermo Fisher公司;FITC标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG，均购自Invitrogen公司。

2方法

2.1引物設计

根据GenBank中登录的hnRNP F序列及流感病毒参考株的PA序列，分别设计扩增引物。

2.2真核表达质粒的构建与鉴定

提取A549细胞总RNA，用Oligo（dT）引物反转录成cDNA，以其为模板，利用设计的扩增引物扩增hnRNP F基因，克隆至pCMV-N-Flag中构建真核表达重组质粒pCMV-N-Flag-hnRNP F。

2.3hnRNP F表达上调对流感病毒复制影响的检测

将pCMV-N-Flag-hnRNP F、pCMV-N-Flag质粒分别转染293T细胞。以MOI 0.01的A/WSN/1933感染过表达后的细胞，利用Western blot检测NP、M1、M2和β-Actin蛋白的表达水平。收集的上清分别感染MDCK细胞统计蚀斑数量。

2.4利用激光共聚焦顯微镜观察流感病毒感染对hnRNP F定位的影响

于铺有A549细胞的激光共聚焦小皿中以MOI 0.1 的A/WSN/1933感染细胞，在感染24 h后用4%多聚甲醛固定。以兔抗hnRNP F（1：500），鼠抗NP单抗（1：500）作为一抗4 ℃孵育过夜，Alexa Fluor-594结合的羊抗鼠IgG（1：500）、Alexa Fluor-488结合的羊抗兔IgG（1：500）为二抗孵育1 h，染核试剂DAPI 5 min。在激光共聚焦显微镜下观察流感病毒感染对hnRNP F蛋白细胞内定位的影响。

2.5利用免疫共沉淀试验检测hnRNP F与流感病毒RNA 相互作用

分别将pCMV-N-Flag-hnRNP F质粒和pCMV-N-Flag质粒转染293T细胞，24h后接种MOI 0.1 A/WSN/1933，感染后30 h，用RIPA裂解液（弱）4 ℃条件下裂解10～20 min，收集细胞裂解液，离心获得上清，加入磁珠，4 ℃摇床过夜。将磁珠分为2部分：一部分利用Western blot检测hnRNP F蛋白的表达水平;另一部分提取RNA。RNA提取后再分为2部分，一部分用Oligo （dT）引物进行反转录，用WSN-PA-F1/R1引物检测病毒mRNA水平，另一部分用Uni 12引物进行反转录，用WSN-PA-F/R引物检测病毒vRNA水平。

3结果与分析

3.1hnRNP F蛋白对流感病毒复制的影响

利用Western blot检测hnRNP F过表达对流感病毒蛋白表达量影响，结果显示在感染病毒8小时时，过表达hnRNP F蛋白组的病毒M2蛋白量低于对照组;感染14 h 后，过表达hnRNP F蛋白组病毒的NP、M1和M2蛋白含量都明显低于对照组（见图1 ）。不同感染时间段病毒上清进行蚀斑滴定，结果显示，感染后14 h和21 h过表达hnRNP F蛋白组病毒效价与对照组相比分别下降2.3倍和6.3倍（见图2 ）。表明上调hnRNP F的表达能抑制流感病毒复制，所以hnRNP F表达对流感病毒的复制发挥负调控作用。

3.2流感病毒感染对hnRNP F蛋白定位的影响

在未感染的细胞内，hnRNP F蛋白定位于细胞核内。在病毒感染的细胞内，当流感病毒出细胞核hnRNP F蛋白也定位于细胞核内。表明流感病毒的感染没有影响hnRNP F蛋白的定位。

4讨论与结论

目前已有诸多文献关于宿主蛋白与流感病毒相互作用的报道。而且关于hnRNP家族蛋白与流感病毒相互作用研究中，已有研究表明核内蛋白hnRNP K能够与流感病毒NS1蛋白相互作用而参与流感病毒复制过程[9];核内蛋白hnRNP A2/B1能与流感病毒NP蛋白相互作用影响病毒复制[10]。

研究首先通过上调hnRNP F表达后，发现该蛋白可显著抑制流感病毒复制。研究发现，核蛋白ANP32能够增强流感病毒聚合酶活性，促进流感病毒复制。而hnRNP F蛋白属于细胞核内的一种RNA结合蛋白，流感病毒的基因片段（vRNA和mRNA）需要在细胞核内合成后出核来发挥不同功能。本研究通过免疫共沉淀试验发现hnRNP F蛋白能够与流感病毒核酸发生相互作用，而激光共聚焦试验显示流感病毒感染并未影响hnRNP F蛋白的定位，说明hnRNP F蛋白可能通过与流感病毒的RNA结合而阻止核酸出核来发挥抑制流感病毒的作用，该推测也需要进一步的试验证实。而且hnRNP F蛋白抑制流感病毒功能位点还有待于进一步研究，这将为抗流感病毒药物研发提供思路。

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