布鲁氏杆菌及检测方法研究进展

包小雅 杨宇昊 翟景波

摘要：布鲁氏杆菌是一种胞内寄生菌，现阶段针对布鲁氏杆菌病主要从细菌学、血清学、分子生物学等几方面进行检测。该文对布鲁氏杆菌及检测方法加以介绍，以期为后续研究提供参考。

关键词：布鲁氏杆菌;血清学检测;分子生物学检测

中图分类号：R516.7文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.001

Research Progress in Brucella and Detection Methods

BAO Xiaoya1，YANG Yuhao2，ZHAI Jingbo1

（Medical School，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China;2.College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China）

Abstract：Brucellosis is mainly detected from bacteriology，serology，molecular biology and so on. In this paper，Brucella and its detection methods are introduced in order to provide reference for the follow-up research.

Keywords：brucella，serological detection，molecular biological detection

0引言

布鲁氏杆菌病（Brucellosis）简称布病，是一种由布鲁氏杆菌引起的人畜共患型传染病。1887年，英国医生Bruce于一病死于“马耳他热”的患者脾脏内分离到了布鲁氏杆菌，自此该病原菌被公布于世。该病流传范围极其广泛，于170多个国家和地区均有流传[1]。世界动物卫生组织（OIE）将布病设为必须通报的动物疫病，我国也将该病列为二类动物疫病。

1病原学

布鲁氏杆菌为革兰氏阴性菌，属α-变形菌，菌体多呈现球杆状，也可见卵圆状，大小为（0.5～0.7）μm×（0.6～1.2）μm，无运动性、无天然質粒，除部分具有毒力的菌株外多数菌株同样不具有荚膜，为兼性胞内寄生。与其他胞内寄生菌相区别的是，该菌不含阴性菌所有的外毒素等毒力因子，且不具有抗原变异性，这些特性可帮助其脱逃免疫防线成功侵入机体内并进行复制。在入侵过程中，布鲁氏杆菌的非经典脂多糖（lipopolysaccharide，简称LPS）可与细胞表面特异性受体进行相互作用，保护菌体不受杀菌肽及补体引发的裂解，从而协助菌体逃避免疫应答，此外该结构在菌体发挥毒性的过程中也起着十分重要的作用[2]。

布鲁氏杆菌可感染多数的哺乳动物及部分两栖动物，目前已知的主要有6种经典类型19个亚型，分别为B.melitensis（羊种，主要感染绵羊和山羊，分为1、2、3亚型）、B.abortus（牛种，分为1、2、3、4、5、6、7、9亚型）、B.suis（猪种，主要感染猪、野兔、野猪、驯鹿和啮齿动物，分为1、2、3、4、5亚型）、B. canis（犬种）、B. neotomae（沙林鼠种）、B.ovis（绵羊附睾种）。之后又鉴定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鳍型）、B.cetacea（鲸型）、B.vulpis（狐狸型）和B.inopinata（人类为天然宿主）5种类型菌种。此外，还有从两栖类动物中分离出布鲁氏杆菌的报道[1]。目前，我国已经分离到该菌的6个经典种及其所有亚型。

2检测方法

2.1细菌学

细菌学检测是布病检测的“金标准”，该检测方法可根据布鲁氏杆菌在无二氧化碳环境下、含碱性品红染剂或不同设置的生化培养基内的生长状态进行细菌的基因分型[3]，在疾病的诊断与流行病学调查上具有重要意义。动物布病检测可选择流产胎儿、阴道分泌物、奶水、血液等组织为样本进行培养。该方法准确性高，但所需时间较长，且布鲁氏杆菌的培养鉴定需在生物安全3级以上的实验室进行操作，分离过程危险性较高，因此不适用于疫情紧急检测[4]。

2.2血清学

由于血清学检测相对简单、成本低、阴性预测值高，在经济和技术资源有限的流行地区，血清学检测仍是主要的诊断工具。目前针对布病已经开发了高效的血清学检测技术，多见于酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验、凝集试验、荧光偏振检测方法和胶体金免疫层析技术。

2.2.1酶联免疫吸附试验

将菌体抗原包被于ELISA板上，若被检血清内含有相应抗体，此时板内则会形成抗原抗体复合物，之后加入酶标二抗，再与酶的底物进行反应产生颜色，最后根据酶标仪检测样品的OD值得出抗体量。该项检测技术准确性高，但操作需要专业技术人员及仪器，因此不适用于基层大规模检测。补体结合试验是通过将布鲁氏杆菌补体结合抗原与待检血清中的抗体结合形成复合物，复合物再与补体结合，从而不再引起指示系统中红细胞溶血的检测方法[5]。该方法敏感性强，特异性高，是OIE认可的血清学检测的标准检测法，多应用于牛羊布病的检测。

2.2.2凝集试验

布病常用的凝集试验为虎红平板凝集试验（RBPT）与试管凝集试验（SAT）。虎红平板凝集是根据虎红平板抗原对IgG类抗体进行检测，操作简单、快速，适用于大范围的布病筛查工作[6]。试管凝集试验则是针对IgM抗体进行检测，不易受非特异性抗体的干扰，假阴性率低，可对疾病进行定性分析[7]。此外，2- 巯基乙醇试验（2-ME）和乳牛全乳环状试验（MRT）也被应用于布病的检测。

2.2.3荧光偏振检测

最早的荧光偏振检测技术是由Nielsen等建立的，主要利用分子旋转特性，来测量抗原与抗体的结合进行检测，但由于检测设备价格昂贵，目前市场上尚未广泛应用该方法进行布病的检测[8]。

2.2.4胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合的以硝酸纤维膜作为载体的固相膜免疫分析技术，该技术检测快速，可被广泛应用于现场的快速检测，在临床上具有广阔的应用前景和极大的发展潜力[9]。

2.3分子生物学

近些年，分子生物学诊断不断取得进展，特别是针对一些培养难度较大的微生物所引起的感染。由于布鲁氏杆菌属的培养条件具有一定特殊性，因此分子生物学检测是其最优的检验方式。布病的分子生物学检测方式以聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、重组酶聚合酶扩增以及环介导等温扩增等4种方法较为多见。

2.3.1聚合酶链式反应（PCR）

近年，PCR检测技术凭借其操作方法简单、准确率高等优势再检测领域占有一定优势。Paul[10]等针对不同基因片段设计了5对引物，建立了可检测布鲁氏杆菌分型的多重PCR方法，之后对80株布鲁氏桿菌进行鉴别检测，成功地区分出了不同种属的菌株。Morata等[11]为评估PCR检测法对布鲁氏杆菌的诊断率，对比了34份不同样品下PCR与常规微生物培养技术的准确率，结果显示PCR准确率为97%，灵敏度远高于培养所得的29.4%。

2.3.2实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是许多实验室诊断的首选方法。该技术将聚合酶链反应与荧光报告分子的使用相结合，以便在PCR反应的每个周期中监测扩增产物。良好的灵敏度和特异性、可重复的数据、低污染风险和减少人工操作时间的相结合，使得实时PCR技术成为传统PCR的一种替代方法。为对该方法灵敏度进行检测，研究者使用SYBR Green I荧光定量PCR对10例布鲁氏杆菌阳性样本进行检测，并与传统的微生物学技术进行了比较。结果显示Wright的血清凝集30%呈阴性，而SYBR Green I荧光定量PCR检测阳性为90%。表明了该检测方法具有良好的敏感度[12]。

2.3.3重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种核酸体外扩增技术，与传统PCR技术不同，该方法在核酸复制过程中形成D型结构，之后双向引物同时复制，从而实现基因片段的指数型增长。且复制的整个过程只需在37～42 ℃的恒温条件下进行即可。Ren等[13]建立了一种用于检测布鲁氏杆菌的重组酶聚合酶扩增方法（RPA），该检测方法可在20 mm内检测到每个反应中至少有3拷贝布鲁氏杆菌。RPA具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优势。

2.3.4环介导等温扩增

与RPA相似，环介导等温扩增（LAMP）同样是是一种快速、简便的DNA检测方法，不同的是该检测方法所需温度为60 ℃。Bhat等[14]应用不同引物及试剂的LAMP进行RT-LAMP检测，并与qPCR结果进行比较。试验结果显示RT-LAMP分析的灵敏度比qPCR高10倍左右。且该检测方法与其他病原菌没有任何交叉反应，其特异性强，是直接和早期检测布鲁氏杆菌的一种特异和快速诊断工具。

3讨论与结论

布病病程较长，为慢性传染性疾病，临床表现不具有特异性，多见于波浪热、关节性疾病以及生殖系统疾病，且严重程度依据个体不同临床差异性较大，这为疾病的治疗增加了极大的难度。动物患病后的临床表现不明显，可见于流产及生殖系统疾病，多数患畜无明显临床表现。

对于布病而言，防控与及时的诊断极为重要，各种诊断手段都存在不同的利弊，必要时需要结合多种检测手法进行共同诊断。日常的防控工作中要注意动物疫苗的注射，现阶段主要应用的疫苗为弱毒苗，基因工程苗也在研究中[15]。

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