Gene Xpert MTB/RIF Ultra检测各类标本的阳性率统计分析

闫晓煜

摘要：目的 使用快速高敏结核分枝杆菌群及利福平耐药基因检测技术（Gene Xpert/RIF Ultra）检测临床常见标本，统计各类标本的阳性率，评估在肺结核病中的诊断价值。方法 选取2021年1月1日～2022年1月1日来我院治疗并进行过Xpert/RIF Ultra检测的患者，符合入选标准的共5890例，其中检测标本为痰液1848例，标本为肺泡灌洗液2634例，其余为组织或其他体液标本1408例。结果 痰液标本中的阳性率为32.25%，肺泡灌洗液的阳性率为35.42%，其他标本总的阳性率为28.56%，全部标本的阳性率为30.08%。结论 Xpert/RIF Ultra检测肺泡灌洗液标本和痰液标本有较高的阳性率;对于无法咳痰或难以取得合格痰液标本的患者，使用肺泡灌洗液标本进行检测很有价值。

关键词：结核病，肺泡灌洗液，Gene Xpert

結核病是由结核分枝杆菌传染而引起的一种慢性传染性疾病，其中以肺部感染最常见，临床上可累及机体多个器官。结核病的主要临床症状为午后低热、盗汗、乏力、消瘦、咳嗽咳痰、咯血、呼吸困难等，对患者的生活质量与生命健康有着严重的影响。研究表明，结核杆菌入侵人体后有不同时长的潜伏期，所以临床早诊断、早治疗非常必要，患者大多可临床治愈，预后良好。结核杆菌培养是临床诊断结核病的金标准，但是培养周期长，难以获得及时有效的实验室检测依据。因此，早期快速诊断成为目前结核病防控面临的主要问题。

临床上，分子生物学方法是一类高敏感的检测方法和技术，能够对样本中的结核杆菌核酸直接检测，不仅可以提升结核病的检出率和诊断效率，而且能够对结核患者及早进行有效的治疗管理。目前，常见的方法有实时荧光核酸恒温扩增技术（SAT-TB）、γ干扰素释放试验（T-SPOT.TB）、肺结核核酸（TB-DNA）定量。SAT-TB是对临床收集的痰液进行液化处理后，加入核酸提取剂100℃10min后提取核酸，最后将提取物进行上机扩增。该方法是在恒温下进行，大大缩短了反应时间，得到结果相对快捷，缺点是实验抗干扰能力差，易出现假阴性，且对痰液中的菌量下限有要求，当标本中抗酸杆菌低于100 CFU/ml时，不易检出。γ干扰素释放试验是采集患者外周静脉血清5ml，置于肝素抗凝管内，并及时将血液加入培养管中，37℃培养16h以上，第二天将培养管离心对血清进行ELISA检测，最终用酶标仪测量并分析结果。此方法灵敏度高，临床应用广泛，但无法为活动性结核与陈旧性结核提供鉴别诊断的依据。TB-DNA最常见的分子生物学检测方法，临床采集患者标本后，实验室对标本进行预处理，待分枝杆菌核酸提取等工作完成后，用荧光定量检测试剂盒检测，在PCR扩增仪（美国ABI，7500）上进行扩增，利用标准曲线法计算出DNA表达量，结果以>400拷贝为阳性，反之为阴性。荧光定量PCR法有内标通道对整个实验过程进行监测，结果相对准确，但扩增时间相对较长，而且核酸提取的过程均为手工操作，预处理花费的时间和精力相对较大。因此，亟须推广自动化的检测方法，减轻检测工作人员的工作负担，提高实验室操作的生物安全性。

根据中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断WS 288—2017的标准[1]，超敏结核分枝杆菌及利福平耐药基因检测（Gene Xpert/RIF Ultra，简称Gene Xpert）在结核病诊断中，表现出检测灵敏度相对较高，且特异度也不低，能够更快地为临床提供早期诊断依据，在临床结核病诊断方面具有非常好的应用前景。GeneXpert系统自进行纯化核酸扩增、单一或复杂样本中的目标序列测定。该系统使用单份/一次性的Xpert检测匣，检测匣内装有PCR反应试剂，以独立进行PCR处理，由于试剂盒采用自成一体的封闭设计，因此使得样本间的交叉污染最小化。目前，临床上最常见的标本类型为痰液和肺泡灌洗液，但由于结核病还存在肺外结核，例如泌尿系结核、消化道结核、结核性脑膜炎及其他局部组织结核感染病等，且Gene Xpert检测费用比较高，这在一定程度上阻碍了其在临床上的推广。因此，对其他类型标本的检测数据进行回顾性分析，检测肺外结核病患者标本类型的阳性率及效能评价十分重要。

1对象与方法

1.1 研究对象

采用回顾性研究方法选取2021年1月1日～2022年1月1日就诊于我院的5890例患者作为研究对象。其中，检测标本为痰液1848例，标本为肺泡灌洗液2634例，其余为组织或其他体液标本1408例，包括组织、引流液、引流条、血液、胸腹水、心包积液、胃液、刷检物、手术切除标本、伤口分泌物、皮损分泌物、脓肿穿刺液、尿液、脑脊液、关节液、骨髓、宫颈分泌物等。患者年龄范围为1～98岁，男性3472例（58.9%），女性2418例（41.1%）。痰液标本中的阳性率为32.26%，肺泡灌洗液的阳性率为35.42%，其他标本总的阳性率为28.56%，全部标本的阳性率为30.08%。

1.2  检测方法

严格按照产品说明书进行操作，根据样本的形状，取标本处理液2ml对1ml标本（1～2倍样本体积处理液）进行液化处理，避免检测标本中有明显颗粒物或者血液，充分振荡10～15s，然后将样本室温下静置15min，在静置5～10min时再次用力振荡10～20次，保证样本充分液化，不应有未液化的痰液细小块状物。根据样本检测数量准备Xpert MTB/RIF检测匣，并在检测匣侧面标注样本编号。打开检测匣的盖子，使用试剂盒内提供的无菌移液管吸取液化前处理好的样本2ml以上（如果样本量不足，不要进行下一步），由检测匣的加样孔缓慢加入（避免形成气溶胶），关闭检测匣盖子。其余液化样本可保存于2～8℃达12 h，以备重复检测使用。结果判读与解释：XpertMTB/RIF检测结果仪器测量荧信号和内设的计算算法来判断，由系统直接报告结果，并在“预览结果”（ViewResults）窗口显示。结核分支杆菌检测基于样本中分支杆菌的 Ct值，结核分支杆菌结果将以高、中、低或非常低来显示。结果分为：检测到利福平耐药、未检测到利福平耐药、利福平耐药不确定。其中，只有在检测到结核分枝杆菌的情况下，才显示利福平耐药的检测结果。

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0统计软件，计数资料数据用（%）表示，组间比较采取卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

痰液组和肺泡灌洗组分别与其他类型标本组进行比较，P<0.05，差异有统计学意义。见表1。

3讨论

近十年来，由于艾滋病患者、糖尿病患者、老年人等特殊人群的数目增长，流动人口增加，多重耐药性结核杆菌增多，以及部分国家地区对结核控制的忽视等因素，全球结核病防控形势十分严峻[2]。传统结核诊断技术涂片镜检法以及结核分枝杆菌培养法尽管有一定的特异性，但都存在不足，如齐尼抗酸染色法涂片镜检敏感度低，容易漏检;培养法耗时长，容易导致延误诊疗，这也是造成结核难以有效被控制的原因之一[3]。众所周知，作为目前临床重要的一线抗结核药物，利福平和异烟肼的耐药现象十分严重，即大部分菌株对利福平耐药的同时，也对异烟肼有耐药性。因此，利用GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药性可作为多重耐药结核杆菌（MDR-TB）的筛选标志，对临床的用药治疗也能提供一定的参考价值。

通常，痰液中检出结核菌是诊断患者患有活动性肺结核病的主要依据，因为存在于肺部病灶坏死组织的大多数结核分支杆菌是通过痰液排出体外的。目前，传统的罗琴氏（LJ）固体培养法阳性率不高，且特异度差，因为各种非结核分枝杆菌（NTM）均可生长，需要结合菌种鉴定方可确定是否为结核分枝杆菌。抗酸染色涂片虽然检测便捷即时，但当标本中的结核分支杆菌数目低于5000条/ml时，极易漏检[4～5]。美国赛沛公司推出的检测技术有着极高的灵敏度，在痰标本中的检测下限为131 CFU/ml，远高于传统的镜检法及其他检测方法;并且GeneXpert MTB/RIF检测技术有操作简便、生物安全性高、抗干扰能力强等特点[6]。近年来，国内外对此项技术的检测敏感性和特异度做了许多回顾性研究，有结果显示，GeneXpert MTB/RIF诊断结核病的特异度达99.2%，灵敏度为 92.2%[7]。针对我院标本种类繁多的情况，本次研究将临床进行了Xpert MTB/RIF的所有患者进行统计，结果显示各种类型标本的阳性率存在明显差异，且说明Xpert MTB/RIF技术在检测不同标本时，敏感度存在差异，但都显示很高的特异度。而肺泡灌洗液阳性率稍高，可能是与临床留取痰标本的合格率有关。因为研究中有学龄前儿童及高龄患者，这类人群很难正确咳痰，送检的标本中唾液较多，对检测结果的阳性率有严重影响。所以，一次检测的阴性结果并不能排除结核病，需不同日期多次留取痰液检测才能提高阳性率，对他们而言，留取肺泡灌洗液标本可能更为合适。

虽然Xpert MTB/RIF有优点很多，但也存在些问题及局限性，例如对临床留取痰液标本质量的要求很高;各类标本的前处理也十分重要，食物残渣、血红蛋白、药物等对结果有一定影响;结果回报的结核杆菌复合群，不能区分标本中的结核分枝杆菌是死菌或活菌等。因此，尽管传统罗氏培养耗时长需要4～8周;抗酸染色镜检法敏感性低，涂片质量以及工作人员阅读能力不同，易造成误诊或漏检;恒温结核RNA检测技术的抗干扰能力差，但结合上Xpert MTB/RIF的快速、高灵敏度和特异度这项新诊断技术，能有效对临床提供病原学诊断依据。

综上所述，Xpert/RIF Ultra检测肺泡灌洗液标本和痰液标本有较高的阳性率;对于无法咳痰或难以取得合格痰液标本的患者，使用肺泡灌洗液标本进行检测很有价值。Xpert MTB/RIF检测技术适合在实验室条件不高的临床试验室推广使用，但该技术也存在一定缺陷，需与结核分枝杆菌的其它检测方法相结合，进一步提高结核分枝杆菌的正确检出率。

参考文献

[1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS288-2017肺结核诊断.2017-11-09.

[2] 黄建斌，杨玲，梁晓莉.Gene Xpert MTB/RIF检测技术在结核病诊断中的应用探讨[J].医学动物防制，2017，33（4）：465，467.

[3] 張治国，欧喜超，孙倩，等.利福平耐药实时荧光核酸扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性研究[J].中国防痨杂志，2013，35（1）：13-16.

[4] 刘佳庆，张丽霞，秦中华，等.Xpert MTB/RIF和 T-SPOT TB对涂阴肺结核诊断价值的评估[J].临床检验杂志，2016，34（10）：755-757.

[5] 赵永，梁庆福，林淑芳，等.Xpert MTB/RIF 检测技术用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测分析[J].中国卫生检验杂志，2015，25（15）：2621-2622，2628.

[6] 付沛文，李世宝，李洪春，等.Xpert MTB/RIF试验快速诊断结核病的研究进展[J].中国感染控制杂志，2017，8（16）：779-783.

[7] 王怡心，陈雄豪，林惠玲，等. Xpert MTB/RIF技术在基层实验室结核病诊断中的应用研究[J].分子诊断与治疗杂志，2015，5（7）：176-179，192.