高效液相色谱仪的使用与故障分析

郁蕉竹 王韵 周长民 张建 许文雅 刘瀛

【摘要】本文介绍了液相色谱原理及仪器构造，总结了在食品检验检测中使用液相色谱仪时遇到的问题及解决方法，提出了液相色谱仪的日常使用方法与注意事项，并对仪器的日常维护保养进行了简单介绍。

【关键词】液相色谱仪;故障分析;食品检验

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.03.023

Application Instructions and Fault Analysis of High Performance Liquid Chromatograph

YU Jiao-zhu 1，WANG Yun 1，ZHOU Chang-min 1，ZHANG Jian2，XU Wen-ya 1，LIU Ying1

（1.Shenyang Food and Drug Inspection Institute，Shenyang 110122，China;2.Sinochem Lantian Fluorine Material Co.，Ltd.，Shaoxing 312300，China）

Abstract：This paper introduces the principle and instrument structure of liquid chromatography，summarizes the problems and solutions encountered in the use of liquid chromatograph in food inspection and detection，puts forward the daily use methods and precautions of liquid chromatograph，and briefly introduces the daily maintenance of the instrument.

Key words：HPLC;fault analysis;food inspection

高效液相色谱仪（HPLC）是近年来被广泛应用的现代分离分析测试仪器[1-2]。由于其具有定量分析结果准确、选择性高、检测灵敏性高、分析速度快等优点，使液相色谱法在化工、医药、卫生、食品[3-5]等领域均有广泛的应用。在食品分析领域，液相色谱法覆盖参数较多，包括食品添加剂、真菌毒素、污染物、农药残留、维生素及营养强化剂相关的多种参数。笔者从事食品液相色谱检验检测工作多年，所在单位开展的高效液相色谱法主要测试的参数有：食品添加剂（苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、丙酸、双乙酸钠、EDTA、纳他霉素等）;着色剂（色素柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝、靛蓝、新红、赤藓红等）;甜味剂（糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、甜菊糖甘、甜菊双糖甘、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、安赛蜜等）;真菌毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、展青霉素、T-2毒素等）;污染物（多环芳烃、苯并芘）;农药残留（氨基甲酸酯类农药及其代谢物多残留、多菌灵等苯丙咪唑类农药残留、吡虫啉、阿维菌素、灭蝇胺、氟磺胺草醚、除虫脲等）;维生素类（烟酸烟酰胺、维生素C、维生素A、D、E和维生素B1、B2、B6等）;营养强化剂（牛磺酸、咖啡因、肉碱、大黄酚、葛根素等）。

在日常的检验工作中，液相色谱仪难免会出现一些问题，通常表现为压力报错、样品不出峰或出鬼峰、保留时间漂移、基线不稳等[6-7]。本文依据食品检验检测多年积累的工作经验，对液相色谱仪在食品检验检测日常操作中出现频次较高的问题提出行之有效的解决方法，并对仪器的日常维护保养进行简单介绍。

1液相色谱仪

1.1液相色谱原理

图1为液相色谱的原理图。如图1所示，当混合样品注入色谱柱后，每个组分有一部分被吸附或溶解在固定相中，而另一部分仍留在流动相中，在色谱柱中连续不断的反复在两相间进行分配交换，最终达到分配平衡。每个组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，分配系数大的组分由于在固定相中停留的机会较多而移动速度较慢，分配系数小的组分由于在固定相中停留的机会较少而移动速度较快。所以，这就导致各组分在色谱柱内形成差速迁移，最终相互拉开距离而被分离。通过检测器对被分离组分的浓度进行检测，通过数据处理系统进行定量。

1.2液相色谱仪器构造

图2为高效液相色谱仪的构造。如图2所示，高效液相色谱仪由分离单元、色谱柱、检测器、数据处理单元组成。

1.2.1分离单元

液相色谱分离单元是一个集成的溶剂和样品管理平台，是在液相色谱上机操作中最需要注意和维护最多的一个单元。它主要由溶剂系统和进样系统构成。溶剂系统主要包括真空脱气装置、高压输液泵、比例阀、在线过滤器、单向阀[8];进样系统包括针头清洗泵、进样注射器装置、定量环。分离单元可以控制以下功能：真空脱气、溶剂混合、样品进样。

1.2.2色谱柱

色谱柱是高效液相色谱仪实现分离过程的核心部件。液相色谱柱由柱体、柱内填料和两端接头组成。色谱柱多为15～30 cm的直型柱，一般为金属材质。样品中各组分在色谱柱上完成分离。食品液相检验检测中使用的色谱柱以C18为主，止匕外，常用的还有C30柱、氨基柱等。

1.2.3检测器

检测器将色谱柱分离出样品的物理或化学特性转换为可以测量的电信号。食品检验检测工作中常用的检测器有紫外检测器、二极管阵列检测器、蒸发光检测器、示差折光检测器、荧光检测器。

1.2.4数据处理单元

数据处理单元可以设置系统参数、监视样品运行、处理检测数据。检测器检测的电信号通过色谱图记录下来，根据标准品的出峰时间、峰面积、光谱图等参数，对样品中待测物质进行定性定量分析。

2液相色谱仪故障分析及解决办法

液相色谱仪在日常使用过程中难免会出现一些故障。最常见的故障有系统失压、系统超压、基线不稳、不出峰或出鬼峰。本文就检验过程中最常见的仪器故障及解决方法进行总结。

2.1系统失压

系统失压的原因包括：1）溶剂系统故障。检查溶剂瓶中是否有液体，流动相是否走空，溶剂管路中是否存在气泡。2）漏液。注意检查色谱柱两端是否拧紧，接头处是否存在漏液现象。3）检查流动相滤头是否堵塞。滤头堵塞可能导致溶剂无法进入管路，导致系统失压。系统失压的解决办法见图3[9]。

2.2系统超压

系统超压的原因包括：预柱、色谱柱堵塞;在线过滤器堵塞;单向阀堵塞;管路堵塞。故障排查方法遵循分段方法，从系统末端，分段的去除管路或模块。系统超压故障排查方法如图4所示。

需要注意的是，单向阀由阀套和阀芯组成，红宝石材质的阀芯容易被乙睛黏住，造成单向阀堵塞。若高效液相色谱仪上次工作使用乙睛作为流动相，则可能因单向阀红宝石阀芯被乙睛黏住而造成系统超压。如遇这种情况，可先对水相管路脱气10-20 min，期间打开排液阀，用注射器多次向外抽气，直到抽出液体，再对乙腈相及其他要用的管路脱气，即可发现各管路脱气压力正常。该方法可在无须拆卸和清洗单向阀的情况下，简单、快捷、高效地解决单向阀堵塞问题。

2.3基线噪音或漂移过大

基线噪音或漂移过大的原因及解决办法如下：1）色谱柱平衡时间不够，特别是流动相含有离子对试剂的条件下，需要色谱柱平衡时间较长。2）系统压力波动大。可能由于溶剂管路中有气泡导致，对各管路脱气，并查看脱气压力。若脱气压力不稳，可能由于溶剂滤头堵塞导致溶剂无法正常输入系统，管路中出现大量气泡，此种情况应取下溶剂滤头并清洗。3）系统中有漏液地方，应分段排查。4）检测器流通池有气泡，用纯甲醇冲洗检测器或增加平衡时间。5）检测器流通池污染，查看检测器灯能量。

2.4不出峰或出鬼峰

系統压力正常，流动相及管线条件正常，仪器条件均正常的条件下，标准样品不出峰，可能的原因及解决办法如下：

1）比例阀故障。需向厂家报修，更换比例阀。2）进样针故障。清洗进样针。3）色谱柱故障。清洗或更换色谱柱。4）检测器故障。查看并设置灯能量参数。

3高效液相色谱仪使用中的注意事项

3.1对流动相的要求

1）保持贮液瓶清洁，定期清洗或更换;2）流动相使用HPLC级溶剂和试剂，且经过过滤以除去杂质微粒，使用溶剂过滤装置，选择水膜或有机膜（0.45 μm或0.22 μm），通过真空泵抽气过滤，同时要定期清洗流动相滤头，以防杂质通过其进人流动相;3）流动相必须预先脱气，否则易产生气泡，影响泵的工作，此外，溶解在流动相中的氧能与某些有机溶剂形成有紫外吸收的络合物，提高背景吸收，在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰;4）含有缓冲盐的流动相使用不得超过2天，防止产生细菌污染管路。

3.2对进样的要求

1）样品进样前要用滤膜过滤;2）在样品量少时，需用内插管，需在方法参数设置时调整针头高度参数，避免进样时内插管将进样瓶插碎。

3.3色谱仪开机时的注意事项

1）运行方法之前对实验所用的溶剂管路脱气，并注意观察脱气时压力，保证管路是灌注过的;2）使用缓冲盐时，要先用大比例水冲洗色谱柱，再用方法所用的流动相平衡色谱柱;3）平衡时间一般为20 min左右，再打开检测器。

3.4色谱仪关机时的注意事项

1）不要阻塞脱气机的排空管路（不要将其放到废液瓶中）;2）使用缓冲盐溶液后要用大比例水相将其从系统中冲走，管路最终保存在纯甲醇中;3）色谱柱进样完成后应按照不同色谱柱的要求，保存在纯甲醇、乙腈或其他溶剂中，色谱柱卸下保存时，要盖上盖子，避免固定相干枯;4）检测完毕要及时关闭检测器灯。

【参考文献】

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