酒轻饮对模型生物解酒护肝和胃肠保护作用的研究

岳林涛 李英 张永杰 魏芳 李艳 李安平

摘 要：目的：探讨酒轻饮对模型生物解酒护肝和胃肠保护作用。方法：采用小鼠肝损伤模型、斑马鱼胃肠黏膜损伤、解酒及肝损伤模型，检测肝指数、胃肠黏膜面积、兴奋期总运动距离及生化指标谷丙转氨酶（Alaninetransaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）含量。结果：兴奋期斑马鱼总运

动距离明显降低（P<0.001）;体内ALT活力检测结果7.81 μL/mL及15.6 μL/mL剂量组明显下降（P<0.01）;昏睡期中高剂量组小鼠翻正反射恢复时间存在显著性缩短（P<0.05）;中剂量组小鼠肝指数明显下降

（P<0.05）;斑马鱼肠腔面积变化明显（P<0.001）。结论：由斑马鱼实验可知，酒轻饮可以起到保护胃肠黏膜、解酒护肝的功效。

关键词：酒轻饮;小鼠;斑马鱼;肝损伤;解酒

Study on the Protective Effects of Jiu Qing Yin on the Liver and Gastrointestinal Tract of Model Organisms

YUE Lintao1， LI Ying1， ZHANG Yongjie2， WEI Fang2， LI Yan1， LI Anping2

（1.Shanxi Zhendong Woohe Medical Care Hall Co.， Ltd.， Changzhi 046000， China; 2.Shanxi Zhendong Pharmaceutical Co.， Ltd.， Changzhi 046000， China）

Abstract： Objective： To explore Jiu Qing Yin on dispel the effects of alcohol， the protective effects of the liver， intestines and stomach of model organisms. Method： Using mouse liver injury model， zebrafish gastrointestinal mucosal injury model， detoxification and liver injury model， the liver index， gastrointestinal mucosal area， total exercise distance during the excitation period and biochemical indicators ALT， AST were measured. Result： During the excitement period， the total movement distance of zebra fish decreased significantly （P<0.001）; decreased in

7.81 μL/mL and 15.6 μL/mL dose groups， ALT activity in vivo was significantly（P<0.01）; during the sleeping period， the recovery time of righting reflex was significantly shortened in the middle and high dose group （P<0.05）; the liver index decreased significantly in the middle dose group （P<0.05）; the intestinal cavity area of zebra fish changed significantly （P<0.001）. Conclusion： According to zebra fish experiment， Jiu Qing Yin can protect gastrointestinal mucous coat， dispel the effects of alcohol and protect liver.

Keywords： Jiu Qing Yin; mice; zebra fish; liver injury; dispel the effects of alcohol

酒，是由一些發酵微生物发酵糖类制成的一种饮料。其主要成分是乙醇[1]。白酒中含有多种风味化合物，包括酯类、醇类、酮类、醛类、酸类、萜烯类及含硫化合物等[2]。饮酒的关键是量的把握。酒带来的危害主要归因于酒精代谢中乙醛的产生，酒精在体内的代谢过程中，大部分酒精是在肝脏中被酶分解代谢[3]。科学研究表明，短期大量摄入酒精易导致急性酒精中毒，长期酗酒则会导致慢性酒精中毒，引起酒精性肝损伤，轻则酒精性脂肪肝，重则肝硬化、肝细胞癌、甚至死亡[4]。

我国饮酒历史长久，对应的也有很多解酒护肝的中药材。桑椹味甘、酸，性寒，归肝、肾经;且《本草纲目》中记载桑椹具有“捣汁饮，解酒中毒;酿酒服，利水气，消肿”的功效[5]。枸杞子味甘、性平，归肝、肾经[6]。现代药理学研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、保肝明目等药理活性[7]。葛根性凉，味甘辛，归脾、胃、肺经，有解表退热、升阳止泻及解酒之功效，具有神经保护和解酒护肝等作用;枳椇子有止渴除烦、利尿解酒之功效[8-9]。代谢组学阐明枳椇子通过调节脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路预防肾上腺脑白质营养不良（Adrenoleukodystrophy，ALD）[9-10]。上述原料配伍组合菊花、甘草及蜂蜜，各原料协同增效，既能缓解醉酒症状，又能保护胃肠道和肝脏等。以上述药食同源中草药为主要原料，经过提取浓缩口味调整配制成一种植物饮料，对其功效进行验证。

1 实验动物

动物模型常用啮齿动物，如昆明小鼠、SD大鼠等[11]。而近年来，因与人类基因同源性高（87%）、易于进行转基因操作等特点，斑马鱼成为了一种公认的新型模式生物[12]。斑马鱼体小、生殖周期短、繁殖力强、易饲养、发育快和成本低，是大鼠的1/1 000;对DMSO耐受，易通过皮肤和腔道吸收药物，最大限度地保留了在体活体的系统性[13]。与传统小鼠实验评价相比较，使用斑马鱼模型进行功效评价，实验周期缩短，克服了在体动物实验强度大、周期较长、存在个体差异的缺陷，兼顾了在体动物模型近似人的整体生物反应，已被国内学者广泛接受[13]。

1.1 实验小鼠

选用KM小鼠150只，SPF级，雄性，体重17～20 g，购自西安交通大学医学部动物实验中心，许可证编号：SCXK（陕）2018-001，批号：20210419，质量合格证编号NO.1431。

1.2 斑马鱼

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，年龄为受精后3 d（3dpf），用于胃肠道黏膜保护作用评价的最大检测浓度，即最小中毒浓度（Minimum Toxic Concentration，MTC）测定及其作用评价;野生型AB品系斑马鱼，年龄为受精后3 d（3 dpf），用于酒轻饮ALT活力降低作用评价最大检测浓度（MTC）测定及其作用评价;年龄为受精后5 d（5 dpf），用于酒轻饮解酒作用最大检测浓度（MTC）测定及其作用评价。

斑马鱼以自然成对交配繁殖方式进行，每实验组为30尾，均饲养于28 ℃的养鱼用水中，由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（001458）的要求[14]。

2 试剂与设备

试剂：AST、ALT测试盒（批号：20210121、20210122，南京建成）;泼尼松（批号C10016501，上海麦克林）;“RU21”（批号：25747，美国精神科学）;美他多辛（批号200401，浙江震元制药）;三硝基苯磺酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid，TNBS，批号：SLBT1675，Sigma）;无水乙醇（批号为20200825，国药集团化学试剂）。

设备：旋涡混合仪（常州市万科丰仪器，XH-T）;台式低速离心机（长沙维尔康湘鹰离心机，TDZ5-WS）;精密电子天平（CP214，OHAUS）;CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技）;行为分析仪（ZebraLab3.11，ViewPoint）;电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon）;多功能酶标仪（SPARK，TECAN，Switzerland）;体视显微镜（SZX7，OLYMPUS）。

3 功效实验

3.1 小鼠实验

小鼠分為5组，分别为正常组，模型组，低、中、高剂量组（2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg），按相应剂量灌胃30 d，末次给药后测定各项指标。酗酒模型在预防性给药7 d后，每天给酒给药，酒灌胃量14 mL/kg bw。测定小鼠的质量，观察动物的皮肤毛发、情绪反应、行为状态、活跃情况等。测前禁食16 h，按要求测定各项指标。

3.1.1 肝脏质量指数

称量小鼠空腹体重及肝脏质量，计算肝脏质量指数。

3.1.2 生化指标测定

末次给药结束后，各组小鼠眼球取血，制备血清，依照AST、ALT测试盒说明方法进行测定。

3.1.3 解酒醒酒实验

解酒：给药30 min后，每只小鼠灌胃给予56度红星二锅头14 mL/kg。醒酒：给酒30 min后，每只小鼠灌胃受试物。各自观察并记录从第1次给酒至翻转反射消失及恢复的时间。正常组按实验先后顺序灌胃二锅头及等量生理盐水。翻转时间：灌酒完成至翻正反射消失的时间;恢复时间：翻正反射消失至翻正反射再次出现的时间。

3.2 斑马鱼实验

3.2.1 胃肠黏膜保护作用评价

随机选取360尾3 dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。除正常组外，其余各实验组均水溶给予TNBS建立斑马鱼胃肠黏膜损伤模型。28 ℃处理2 d后，移除TNBS，分别水溶给予酒轻饮3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1 000 μL/mL浓度，阳性组泼尼松15.0 μg/mL浓度，同时设置模型组和正常组（养鱼用水处理），每孔容量为3 mL。处理结束后，观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况，确定酒轻饮的MTC;取MTC及以下共3个浓度组：阳性组、模型组和正常组，每组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠腔面积（A），以肠腔面积的统计学分析结果评价酒轻饮胃肠道黏膜保护作用。在拍摄分辨率及相关参数相同情况下，像素点越多，面积越大，故用像素作为单位，不再计算实际面积。

3.2.2 解酒作用评价

随机选取360尾5 dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，水溶给予无水乙醇建立斑马鱼兴奋期醉酒模型。分别水溶给予酒轻饮3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1 000 μL/mL浓度，阳性组“RU21”100 μg/mL浓度，同时设置模型组和正常组（养鱼用水处理斑马鱼），每孔容量为3 mL。处理结束后，观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况，确定酒轻饮的MTC;取MTC及以下共3个浓度组、阳性组、正常组和模型组，每组随机选取12尾斑马鱼，用行为分析仪软件分析并采集数据，分析斑马鱼总运动距离（S），以总运动距离的统计学分析结果评价酒轻饮解酒作用。

3.2.3 ALT活力降低作用评价

随机选取360尾3 dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予酒轻饮3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1 000 μL/mL浓度，阳性组美他多辛149 μg/mL浓度，同时设置模型组和正常组（养鱼用水处理斑马鱼），每孔容量为3 mL。除正常组外，其余各实验组均水溶给予无水乙醇建立斑马鱼酒精性肝损伤模型。处理结束后，观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况，确定酒轻饮的MTC;取MTC及以下共3个浓度组、阳性组、模型组和正常组，用ALT试剂盒通过多功能酶标仪检测斑马鱼体内ALT活力（H），以ALT活力的统计学分析结果评价酒轻饮ALT活力降低作用。

3.3 数据分析

实验数据以mean±SE表示，采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，采用方差分析及LSD-t检验。

4 实验结果

4.1 小鼠实验结果

小鼠实验结果如表1所示。①肝脏指数。模型组与正常组比较存在显著性差异。剂量组与模型组比较，中剂量组存在差异性，低、高剂量组无统计学意义。②ALT、AST活性。模型组与正常组比较，无统计学意义。③解酒醒酒。剂量组与正常组比较，高剂量组解酒恢复时间和中、高剂量组醒酒恢复时间存在差异性。

4.2 斑马鱼实验结果

4.2.1 MTC

由表2可知，在胃肠道黏膜保护作用实验中，酒轻饮浓度达到62.5 μL/mL时，斑马鱼并未出现明显异常，高于此浓度后，死亡率直线上升;在解酒作用实验中，酒轻饮浓度达到31.3 μL/mL时，斑马鱼出现异常，较模型组状态差，高于250 μL/mL浓度后出现死亡，死亡率直线上升;在ALT活力降低作用实验中，酒轻饮浓度达到15.6 μL/mL时，并未出现明显异常，高于此浓度后，死亡率直线上升。可知本实验条件下，胃肠道黏膜保护作用评价MTC为62.5 μL/mL;解酒作用评价MTC为15.6 μL/mL;ALT活力降低作用评价MTC为15.6 μL/mL。

4.2.2 作用结果

根据MTC设计浓度梯度进行实验，见图1，阳性对照组、31.3 ?L/mL及62.5 ?L/mL组别均可显著降低斑马鱼肠腔面积，可提升肠胃黏膜保护作用。由表3可知，与模型组相较而言，阳性对照及剂量组均可提升总运动距离，兴奋期明显延长，解酒效果明显;降低ALT活力，对酒精引起的脏器保护作用明显。

5 结论与讨论

酒精中毒是指乙醇饮用过量而导致的机体损伤，尤其作用于神经中枢和肝脏[11]。急性酒精中毒过程常分为3个阶段，即兴奋期、共济失调期、昏睡期[11]。兴奋期采用斑马鱼模型，MTC检测可清楚分辨兴奋期，准确确定剂量，对兴奋期斑马鱼总运动距离和ALT活性进行检测。昏睡期采用小鼠模型，进行肝指数、ALT、AST和翻正反射消失实验，此实验是观察处于异常体位的动物是否能恢复正常体位来确定动物的反射状况，是判断动物是否醉酒的经典方法[11]。肝组织作为解酒的重要器官。酒精引发肝脂肪变性，导致肝指数上升，肝组织中的ALT、AST酶流入血液，检测此3项可反应机体对酒精的处理情况及肝保护情况。乙醇刺激可导致胃肠黏膜损伤，长期过量刺激可导致急慢性胃肠炎，实验采用斑马鱼胃肠黏膜损伤模型，研究对于胃肠黏膜的保护作用。

由上述实验结果可知，在兴奋期，剂量组与模型组比较，斑马鱼总运动距离明显降低，斑马鱼进入兴奋期推迟，机体解酒能力提升;体内ALT活力检测结果7.81 μL/mL 及15.6 μL/mL剂量组明显下降，斑马鱼肝损伤程度下降，ALT活力降低作用明显。昏睡期，中高剂量组，翻正反射恢复时间存在显著性缩短，体内转化乙醇能力增强。ALT、AST活力无显著性。肝指数中剂量组明显下降，肝脏器官病变肿大情况减弱。胃肠保护作用研究中，斑马鱼肠腔面积变化明显，酒轻饮对于TNBS引起的胃肠黏膜损伤有很好的保护作用。

本实验在不同实验方向选用动物品种和模型不同，期望从多角度研究酒轻饮的作用。但结果不尽人意，未达到预期效果，显著性不同。酒轻饮对于小鼠模型检测效果不佳，生化检测指标无显著性，行为检测结果存在显著性，但剂量关联不明确，由数据看，可能存在剂量设计不合理问题，待后续继续研究;对3种模型斑马鱼的保护作用显著，与斑马鱼同尾产出，个体差异小结果效果显著相符，但作用效果与剂量关系关联不明确[13]。本實验方案虽结合小鼠及斑马鱼动物模型，但小鼠及斑马鱼无法相互验证，斑马鱼实验在酒精中毒兴奋期进行检测，而小鼠实验翻正反射在昏睡期进行。由斑马鱼实验可知，酒轻饮可以起到保护胃肠黏膜，解酒护肝的功效，但在毒理和量效关系上需进一步进行研究。

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作者简介：岳林涛（1990—），男，山西长治人，本科，研究员。研究方向：药食同源中药材及其制品功效。