不同培养基和取样方式对泾阳茯砖茶中冠突散囊菌计数的影响研究

秦婧 舒静 刘静 石菲 孟怡璠

摘 要：以陕西市售泾阳茯砖茶为样本，检验方法依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016），培养基采用孟加拉红培养基、PDA培养基和察氏培养基，研究冠突散囊菌在3种不同培养基上的计数情况;比较传统五点法和对角线五点法两种取样方式对冠突散囊菌检测结果的影响。研究发现，察氏培养基不适合作为冠突散囊菌的计数培养基，孟加拉红和PDA均可作为冠突散囊菌计数培养基;取样方法对冠突散囊菌菌落计数的影响不明显，且受到取样人员手法、茯砖茶样品菌落分布不均匀等因素的影响较大。

关键词：茯砖茶;冠突散囊菌;培养基;五点法

Study on the Effects of Different Media and Sampling Method on the Counting of Eurotium cristatum in Fuzhuan Tea of Jingyang

QIN Jing1， SHU Jing1， LIU Jing1， SHI Fei1， MENG Yifan2

（1.Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection， Xian 710048， China; 2.Hanzhong Center of Food and Drug Supervision， Inspection and Testing， Hanzhong 723000， China）

Abstract： Taking Jingyang Fuzhuan tea sold in Shaanxi province as the sample， the inspection method was based on GB 4789.15—2016， and the culture medium is Rose Bengal Agar， Potato Dextrose Agar （PDA） and Czapek-Dox Agar medium， and the count of Eurotium cristatum on three different mediums is studied， and this paper compares the influence of traditional five-point method and diagonal five-point method on the detection results of Eurotium cristatum. It was found that Czapek-Dox Agar was not suitable for the count of Eurotium cristatum and both Rose Bengal Agar and PDA could be used for the count of Eurotium cristatum. Sampling method has no obvious influence on colony count， and is greatly influenced by sampling method and uneven distribution of colony of Fuzhuan tea tea sample.

Keywords： Fuzhuan tea; Eurotium cristatum; medium; five-spot method

產自陕西泾阳的茯砖茶历史悠久，自明朝洪武年间至今已有600多年历史。如今泾阳茯砖茶已经成为陕西省地理标志产品，成为陕西省对外的一张文化名片。茯砖茶属于黑茶的一类，为后发酵茶，泾阳茯砖茶与其他种类的后发酵茶相比，其特殊之处在于“发花”这一加工工艺过程给茯砖茶带来的自然益生菌体“金花”，学名为冠突散囊菌[1]。冠突散囊菌是一种真菌，属于散囊菌目发菌科散囊菌属，这种真菌经过“发花”后在砖茶中形成直径在100～175 μm的金黄色“金花”颗粒，故又称“金花菌”[2]。由于冠突散囊菌以茯砖茶为基质，经发酵使得茯砖茶的成分发生了变化，产生了氧化产物和水解产物，以及有机酸等活性物质，不仅形成了茯砖茶特有的色、香、味，也使茯砖茶具有调脂减肥、改善人体消化道功能、治疗心血管疾病等保健功效[3]。

冠突散囊菌形成的“金花”颗粒与茯砖茶基质和其他种类杂菌形成的菌落有较大的差别，且由于具有诸多对人体有益的功效，“金花”在茯砖茶中的数量和质量是判断茯砖茶质量优劣的一项重要且独特的指标。本文针对茯砖茶茶体“金花”菌落中冠突散囊菌的数量进行计数检测，使用不同的取样方法进行冠突散囊菌菌落的取样，并采用多种培养基进行培养。在取样方法的选择上，由于地方标准《食品安全地方标准 泾阳茯砖茶》（DBS 61/0006—2014）中并未规定取样方法，本文采取传统五点法作为第一种取样方法。由于传统五点法的取样位置较为固定和集中，针对分散分布的菌落进行采样时难免发生错漏，有一定局限性，所以选择对角线五点法作为第二种取样方法，两种取样方法互为对比和补充。冠突散囊菌的检验方法依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15-2016）[4]。但该法中采用的培养基及培养条件并非冠突散囊菌的最适生长条件，且取样方法并不能准确地体现茶叶中冠突散囊菌的实际含量，对冠突散囊菌的检测针对性也不强。所以在《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）所规定的检验方法上加以改进，在该标准规定的两种琼脂培养基的基础上，添加更适于真菌培养的察氏培养基作为培养基方面的对比方案。综上，本文旨在研究冠突散囊菌在3种培养基，即孟加拉红琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基和察氏培养基上的生长情况，并且将传统五点法取样和对角线五点法取样两种取样方法对冠突散囊菌生长的影响进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

14批次茯砖茶样品均来自陕西市场市售，编号为01～14。茯砖茶样品的采集和制备过程均符合《紧压茶 第3部分：茯砖茶》（GB/T 9833.3—2013）[5]中对茯砖茶感官品质、理化指标、卫生指标等的要求。

孟加拉红琼脂培养基、PDA培养基、察氏培养基均来自北京陆桥技术股份有限公司;霉菌培养箱为上海新苗医疗器械制造有限公司生产的MJ-250BSH-Ⅱ型环保型霉菌培养箱，该型培养箱温度波动范围为±0.5 ℃，满足《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）对培养箱温度波动范围不大于±1 ℃的要求;均质器采用宁波新芝生物科股份有限公司生产的SCIENTZ-Ⅱ超声波细胞粉碎机;电子天平、无菌吸管、无菌试管、恒温水浴箱和显微镜等其他试验设备和材料的选择均满足《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）的要求。

1.2 实验方法

1.2.1 3种培养基比对

（1）取样。在研究3种培养基对冠突散囊菌的影响时，取样方法统一采用传统的五点法取样，即距离茯砖茶四角1 cm处的4个点取样、茯砖茶中心点取样，每个点取样5 g左右。

（2）稀释和培养。检测方法依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》

（GB 4789.15—2016）。称取25 g样品，加入225 mL无菌生理盐水，用拍击式均质器拍打1 min制成10-1的样品匀液。取1 mL 10-1的样品匀液注入含有9 mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上混匀，即为10-2的样品匀液，依次稀释得到10-3、10-4、10-5样品匀液。选择10-3、10-4、10-5样品匀液，每个稀释度分别吸取1 mL于2个无菌平皿内，同时分别取

1 mL无菌生理盐水加入2个无菌平皿作空白对照。由于要比对3种培养基，每个稀释度应做3份样液。加样完成后，及时将20～25 mL冷却至46 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、察氏培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，待凝固后置（28±1）℃培养箱中培养。从第3 d开始每天观察并记录结果直至培养至第5 d，选取菌落数在10～150 CFU的平板进行计数。

1.2.2 两种取样方法比对

在研究两种取样方法的影响时，培养基统一采用孟加拉红琼脂培养基。分别采用传统五点法和对角线五点法取样，传统五点法的取样过程见1.2.1（1）。对角线五点法的取样过程为选取茯砖茶茶体矩形的任一条对角线（本文统一选取左对角线）在其上均匀选取五点进行取样，每个点取样5 g左右，其中首尾两点须距离茯砖茶两角1 cm。稀释和培养的步骤见1.2.1（2）。

2 结果与分析

2.1 培养基比对

由表1可知，根据14组样品的菌落计数结果进行分析，发现在孟加拉红琼脂培养基和PDA培养基上所培养的冠突散囊菌菌落计数相差不大，而在察氏培养基所培养的菌落计数则普遍结果更大。此外，察氏培养基不仅计数结果偏大，其上的“金花”形态较孟加拉红琼脂培养基和PDA培养基上的也要更大，形态更加不规则，不便于冠突散囊菌菌落的计数。孟加拉红琼脂培养基和PDA培养基是常用的霉菌、酵母菌计数培养基，而察氏培养基则常用于霉菌、真菌的鉴定。根据对3种培养基上菌落计数数据和菌落形态的分析，察氏培养基不适合作为冠突散囊菌菌落的计数培养基，而孟加拉红琼脂培养基和PDA培养基则均比较适合作为冠突散囊菌菌落计数培养基。

2.2 取樣方法比对

由表2可知，即使取样方法同为传统五点法或同为对角线五点法，依然存在同一检验员检测数据重复性较差、同一组样品结果不一致且不呈现任何规律性的问题。一些茯砖茶样品从外观上来看，“金花”菌落分布不均匀，且无论采取传统五点法还是对角线五点法均存在取样不均匀的问题。“金花”菌落位于茯砖茶的砖面和砖底的中部，砖表面1 cm区域通常没有或极少有“金花”菌落的生长，故取样位置不正确，极易造成冠突散囊菌菌落漏检或菌落计数检测不准确[6]。这一点对于规格较小的茯砖茶茶体样品（定义为重量低于100 g的样品），无论传统五点法和对角线五点法都存在取样困难、检测准确度低的问题。

2.3 操作要点分析

茯砖茶茶体样品中冠突散囊菌菌落计数的检测采用《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）。采用该标准在操作时需要注意的事项有：①必须用拍击式均质器均质1～2 min，不可仅手动摇匀;②梯度稀释时每个稀释度的试管必须在涡旋混匀仪上混匀5～8 s，不可仅手动摇匀。这是因为样品若不均质或混匀，冠突散囊菌的孢子无法充分释放到稀释液中，易造成检测结果菌落数偏低或偏高，菌落计数检测结果失真。

3 结论

综上，察氏培养基不适合作为冠突散囊菌菌落计数的培养基，而取样方法对冠突散囊菌菌落计数的影响不明显，且受到取样人员手法、茯砖茶样品菌落分布不均匀等因素的影响较大。

参考文献

[1]吕嘉枥，孟雁南，史朝烨，等.基于图像处理技术快速检测茯砖茶中“金花菌”数量[J].现代食品科技，2018，34（11）：220-226.

[2]齐祖同，孙曾美.茯砖茶中优势菌种的鉴定[J].真菌学报，1990（3）：176-179.

[3]屠幼英，梁慧玲，陈喧.紧压茶儿茶素和有机酸的组成分析[J].茶叶，2002（1）：22-24.

[4]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数：GB 4789.15—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.紧压茶 第3部分：茯砖茶：GB/T 9833.3—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

[6]李宏梁，辛乐，舒静，等.茯砖茶中冠突散囊菌检测过程关键步骤探讨[J].食品科技，2017，42（11）：331-335.