基于脱氧核酶-荧光共振能量转移效应的食品中 铅离子快速检测

刘玉梅，史雅辰，任尧，邓锐杰，赵志峰，何强

（四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065）

铅是人体非必需金属元素[1]，人体微量暴露即具有潜在的生殖毒性[2]、神经毒性[3,4]和基因毒性[5]。相较于其它金属离子，铅离子具有较长的半衰期[6]及一定的生物富集性[7]。在人体富集后会诱发关节炎[8]、肝肾损伤[9]，甚至癌症[10]。饮水[11]、膳食[12]、呼吸[13]和皮肤接触[14]是铅离子暴露的主要形式，因此有必要对食品及环境中的铅离子进行监测。传统的铅离子检测方法[15]如石墨炉原子吸收光谱法（Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry，GFAAS），电感耦合等离子体质谱法（Inductively-Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）和火焰原子吸收光谱法（Flame Atomic Absorption Spectroscopy，FAAS）作为食品中铅测定的国标方法，检测灵敏、结果准确。然而这些方法需要专业的技术人员操作、依赖昂贵的实验室设备，同时存在样品前处理复杂、检测时间长等问题。

脱氧核酶（DNAzymes）是通过体外指数富集的配体系统进化筛选技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选出的单链DNA序列，在溶液中可自我折叠形成复杂的三维结构，具有可设计性、可组装性、可储存性及高效的催化活性[16]。不同的脱氧核酶可被特定的金属离子激活，如铅离子[17]、铀酰离子[18]、钠离子[19]、银离子[20]、铊离子[21]等。脱氧核酶具有极高的特异性及稳定性，因此是铅离子检测体系的常见构成单元。Li等[22]将脱氧核酶与Cas12a蛋白结合起来用于快速、高效地检测铅离子。该方法十分灵敏，检出限仅为0.053 nmol/L，然而该反应依赖于昂贵的Cas蛋白及转录、磁分离技术，操作较为复杂。

荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是处于激发态的供体将能量转移给邻近处于基态的受体，即是一种表征和探测相邻供体和受体之间相互作用的技术。供体与受体间距离不同，FRET效率不同，因此FRET效率可以反应供体与受体之间的距离。鉴于FRET效应的灵敏性及灵活性，FRET已被应用于监测脱氧核酶的构型变化、核酸链之间的结合情况及金属离子介导的酶切过程等。He等[23]基于金纳米离子与TAMRA基团之间的FRET效应设计了一种灵敏、精确的铜离子检测荧光传感器。Chen等[24]将杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction，HCR）与FRET结合起来用于铜离子的检测。Liu等[25]将碳点、金纳米棒与FRET效应结合起来设计了一种“Off-On”型的生物传感器。不仅如此，Yang等[26]设计了一种可以在单细胞内灵敏检测铅离子的传感器，检出限仅为10 nmol/L，远低于世界卫生组织的相关标准。然而这些方法设计较为复杂、耗时长、需要扩增反应、成本较高。

本文基于脱氧核酶对铅离子的高度选择性及FRET效应对供体、受体间距离感知的灵敏性，设计了一种操作简单、不依赖扩增的室温铅离子快速检测方法。当铅离子存在时，脱氧核酶在特定位点切割底物链并释放修饰了BHQ1猝灭基团的断链，因此供体分子的荧光得以保存。该方法成功应用于自来水及鸡蛋中铅离子的检测，有望用于食品重金属污染的现场检测分析。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

表1所示DNA序列均购于上海生工生物技术有限公司（中国上海），其中底物链GR-B为HPLC纯化，并在5’端修饰了荧光猝灭基团BHQ1，其余序列均为PAGE纯化。EvaGreen（20×），美国赛默飞公司；醋酸铅标品，美国默克公司。氯化钠、氯化镁和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），阿法埃莎（中国）化学有限公司（中国上海）。Tris-HCl，成都金山化学试剂有限公司（中国成都）；醋酸锰，天津大茂化学试剂厂（中国天津）。氯化钴、硝酸铬、硫酸铜、硝酸铝、氯化镍、氯化钾、硝酸和高氯酸，成都科龙化学试剂厂（中国成都）。50× TAE buffer、10000× Gel Red，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。6× Loading buffer，北京擎科生物科技有限公司。琼脂糖及25 bp-500 bp DNA marker，生工生物工程（上海）股份有限公司。实验用水为分子级生物水，美国康宁公司。实验所用仪器为多功能酶标仪Biotek Synergy H1（美国博腾）、电泳仪（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、凝胶成像仪Gel Doc XR+System（美国伯乐）。

表1 核苷酸序列表Table 1 Nucleotide sequences

1.2 铅离子检测体系

40 μL铅离子检测体系包括4 μL 10× buffer（buffer组成为50 mmol/L HEPES，50 mmol/L氯化钠，5 mmol/L氯化镁，pH 7.26）、3 μL 4 μmol/L底物链、1 μL 4 μmol/L不同臂长的酶链、2 μL 20× EvaGreen、26 μL水及4 μL不同浓度的铅离子。混合均匀后立即吸取35 μL测定荧光值并计算信噪比。信噪比为实验组荧光信号值与空白组荧光信号值的比值。

1.3 光谱分析与凝胶电泳分析

EvaGreen的激发波长为480 nm，发射波长范围为510～650 nm，步幅为2 nm，最大发射波长为530 nm。电泳时上样5 μL，电泳电压为90 V，电泳时间为1 h。

1.4 实际样品检测

新鲜鸡蛋及自来水样品用于检测该方法的可行性。新鲜鸡蛋购自超市（中国成都），自来水样品取自实验室。鸡蛋提前进行消化处理，取0.5 mL充分混匀的蛋液、10 mL 70%的硝酸和0.5 mL 70%的高氯酸于消化管中，置于消化炉上按以下程序进行消化：120 ℃ 1 h，180 ℃ 3 h，200 ℃ 1 h。用1 mol/L KOH将剩余溶液的pH值调节至7.0左右，最后用该溶液配制不同浓度的铅离子溶液，置于4 ℃备用[27]。

1.5 数据分析

每个样品设三个平行组，测定结果以平均值±标准差表示。数据分析采用Prism 8.0，绘图采用origin 8.0。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

本文设计了一种检测铅离子的“Turn on”型传感器，其原理如图1所示。当底物链与酶链杂交时，形成的复合物具有部分双链DNA的性质。EvaGreen染料是一种非特异识别双链DNA的荧光分子，因此可以识别底物链与酶链的杂交复合物。由于底物链的5’端修饰有BHQ1荧光猝灭基团，当体系中没有铅离子时，BHQ1与EvaGreen处于邻近状态，此时在480 nm处激发时将产生FRET效应，供体为EvaGreen分子，受体为BHQ1基团。受BHQ1的影响，供体EvaGreen的荧光会有明显的猝灭现象。当铅离子存在时，酶链被激活，底物链被切割，降低了5’端底物链与酶链的杂交稳定性[28]，并释放5’端底物链。此时EvaGreen与BHQ1之间的距离增大，而FRET效应又与供体、受体分子之间的空间距离密切相关[29]，因此EvaGreen与BHQ1之间FRET效应减弱，EvaGreen的荧光得以保留，基于铅离子诱导的FRET效应减弱可以灵敏地检测体系中的铅离子。在“Turn off”型传感器中，当铅离子存在时，EvaGreen的荧光仅略微减弱，且“Turn off”型传感器容易产生假阳性和检测灵敏度较低的问题。后续实验将探究这两种传感器对铅离子响应的灵敏程度。

2.2 原理验证

为了验证“Turn on”型传感器及“Turn off”型传感器对体系中铅离子的响应灵敏度。在相同实验条件下探究了其荧光变化程度。由图2a可知，对“Turn off”型传感器而言，当铅离子存在时，EvaGreen的荧光略微下降，原因是铅离子诱导了底物链的断链，降低了5’端底物链与酶链的杂交稳定性，而3’端底物链与酶链结合较为稳定，所以EvaGreen的荧光对底物链的断裂并不十分敏感，荧光值仅下降9.64%。对“Turn on”型传感器而言，当铅离子存在时，EvaGreen的荧光值有明显升高现象，相较于空白组升高了116.37%，这是因为FRET效应的受体BHQ1对供体EvaGreen的荧光有良好的吸收作用。图2b分别分析了“Turn on”型与“Turn off”型传感器对铅离子响应的显著程度。结果可知“Turn off”型对铅离子的响应并不灵敏，因此在同等条件下“Turn on”型传感器更具有优势。

图2c探究了铅离子及底物链（GR-B）本身对EvaGreen荧光值的影响，由图2a及图2c中①④可知铅离子可以诱导EvaGreen荧光值的显著上升。因此首先探究铅离子本身对EvaGreen荧光值的影响，如图2c中②③所示，铅离子本身并不能使EvaGreen的荧光值升高。同时探究了铅离子本身对猝灭基团的影响，由图2c中⑤⑥所示，GR-B的荧光很低，加入铅离子后也不会导致荧光的改变。同时对比图2c中②③与⑤⑥可以发现，BHQ1与EvaGreen之间的FRET效应可以显著降低实验背景，得到更准确的实验结果。图2d验证了铅离子对脱氧核酶的特异性识别及核酶对底物链的特异性切割作用，当底物链（泳道2）与酶链（泳道3）同时存在时，二者杂交产生了新的二聚物条带（泳道4），当铅离子存在时有了更短的片段产生（泳道5），说明铅离子可以作为辅酶对底物链进行切割，释放与酶链杂交不稳定的5’端底物链。

2.3 实验条件优化

为了得到更好的实验结果，分别对酶切反应时间、脱氧核酶的酶链臂长、EvaGreen浓度、底物链与酶链的比例进行了优化（图3）。反应时间直接决定了底物链与酶链之间形成的杂交复合物的量及EvaGreen嵌入双链的多少，间接决定了FRET效应的强弱，因此首先对酶切时间进行了优化。由图3a可知，随着反应时间的延长，实验组与空白组的荧光值都有一定程度的升高，然而信噪比在加入铅离子的一瞬间即达到最大值，这说明铅离子的切割是高效的，并能及时释放断裂的5’端底物链，减弱FRET效应。接下来对酶链臂长（15 nt-X nt）进行了优化，过长的臂长将影响断裂的底物链从酶链上分离，过短将影响核酶的切割活性。由图3b可知，随着酶链5’端的延长，实验组与背景组的荧光强度都有显著升高，当酶链臂长为15 nt～5 nt时，有最大信噪比。EvaGreen浓度优化的实验结果如图3c所示，随着EvaGreen浓度的增加，背景与信号的荧光值都有显著增加，当浓度为1×时，信噪比逐渐趋于稳定并达到最大值。最后对底物链及酶链的比例进行了优化，由图3d可知，当酶链浓度与底物链浓度分别为400 nmol/L与100 nmol/L时，有最大信噪比。因此后续实验将采用15 nt～5 nt的酶链（GR15-5）、1×的EvaGreen、400 nmol/L的酶链与100 nmol/L的底物链并在室温条件下混匀后立即进行荧光检测。 浓度依次为800、100 nmol/L；600、100 nmol/L；400、100 nmol/L；200、100 nmol/L；100、100 nmol/L；100、200 nmol/L；100、400 nmol/L。

2.4 铅离子定量分析

在优化的实验条件基础上，探究铅离子浓度与荧光信号之间的关系。由图4a可知，随着铅离子的增加（0、0.1、1、10、30、50、100、500、1000、2000 nmol/L），EvaGreen的荧光值逐渐升高，这是因为铅离子的增加加速了底物链的切割。铅离子与荧光信号之间的线性关系如图4b所示，在0 nmol/L到50 nmol/L铅离子浓度范围内，铅离子浓度与荧光强度之间拟合得到标准曲线为y=86.98x+3097.90（R2=0.997），其中y代表加入铅离子后EvaGreen的荧光强度，x代表对应的铅离子浓度。根据36原则计算得到检出限（LOD）为5.80 nmol/L。同时，在相同实验条件下，对“Turn off”型传感器的灵敏度进行了探究，结果表明在没有足够的酶切时间条件下，几乎没有荧光变化，因此在与“Turn on”型同等实验条件下无法做出有效的关系曲线（数据并没有展示）。食品的原产地不同，不同食品原料中的铅离子含量大有不同，不同的食品原料在生长过程中对铅离子的富集能力不同。因此该方法有望用于多种不同产地的不同食品中的铅离子污染检测。

2.5 选择性实验

食品原料组成复杂，有的本身就富含金属离子。为了验证本方法对铅离子的选择性，分别取10、50、500 nmol/L的铅离子、镉离子、镍离子、钴离子、铝离子、锰离子和铜离子用于分析选择性。由图5可知，除了铅离子有明显信号响应之外，其它金属离子的荧光信号在不同浓度梯度的范围内变化不大，这是由于只有铅离子能作为酶链的辅酶因子激活其活性，其它的金属离子并无此作用。脱氧核酶对铅离子的高度选择性保证了本实验设计的高度特异性。因此本方法有望用于复杂的食品样品中的铅离子检测，并得到较为准确的结果。

2.6 实际样品检测

鸡蛋是常见的食品原料，环境中的铅离子容易以禽类为媒介富集到鸡蛋中。同时饮水也是人体摄入铅离子的主要形式之一。为了验证本设计有一定的应用可能性，选择新鲜鸡蛋及自来水为样品，分别配置30、40、50 nmol/L的实际样品待检液用于检测，结果如图6所示。可以发现该方法有良好的回收率（86.79%～ 113.32%），其中鸡蛋与自来水检测结果的差异可能是由于它们本身的特性决定的，因此该方法有望用于实际样品的现场检测。同时本文比较了不同基于核酶的铅离子检测方法，结果如表2所示。

表2 基于核酶的铅离子检测方法Table 2 DNAzyme-based Pb2+ detection methods

3 结论

本文构建了一种基于脱氧核酶和FRET效应的铅离子快速检测方法，该方法操作简单，具有高度的选择性并成功应用于复杂的实际样品检测。相比之前的核酸探针检测方法，该方法原理简单，反应灵敏，与便携式荧光计结合有望用于现场监测不同复杂样品中的铅污染，同时该方法也为设计其它金属离子检测传感器提供了思路。