功能化水刺粘胶纤维膜的制备及其在漆酶固定化中的应用

刘 锁， 王雅倩， 魏安方， 赵 磊， 凤 权

(1. 安徽工程大学 纺织服装学院， 安徽 芜湖 241000；2. 江南大学 教育部针织技术工程研究中心， 江苏 无锡 214122)

工业生产中，大量含氨氮有机物的废水对生态系统的平衡构成了巨大的威胁。这些污染物可以通过多种环境介质远距离迁移，具有长期残留、生物积累和高毒性[1-2]。漆酶作为使用最广泛的多酚氧化酶，对酚类、芳香环和羧酸的衍生物等多种底物具有良好的催化降解能力，且催化降解的最终产物都是无毒的小分子物质[3-4]。然而，生物酶对环境敏感性较强，在高温、强酸、强碱和有机溶剂等反应条件下易发生变性或失活，不易长期储存，不能重复使用，这在一定程度上阻碍了酶的广泛应用。

酶的固定化是指通过物理或化学的方法使生物酶与载体相结合，提高其抵抗外部环境对酶活性的影响，同时实现对生物酶回收和重复使用的一种技术。该技术不仅可以改善酶的稳定性，减少或者避免酶对产物的污染，而且方便酶的回收和重复使用，从而大大降低处理成本[5-6]。目前采用的酶固定化载体主要是价格较为便宜的无机材料、磁性粒子、高聚物和介孔材料等[7-8]，但其与酶结合之后通常会造成酶的重复使用性能较差和酶活损失较为严重等问题。选择合适的载体对提高固定化酶的催化性能有至关重要的影响。优异的载体不仅应该具有较高的性价比，更重要的是要具有良好的物理和化学稳定性、较高的酶负载能力和不对环境造成二次污染等特性。

近年来，纺织材料由于大的比表面积和易于功能化修饰等优点被广泛用于固定化酶的研究[9-10]。水刺粘胶纤维膜具备较多的羟基官能团，将其进行加工修饰后通过配位法[11-12]固定化酶，能够提高其对漆酶的固定化量、活性稳定性，可作为固定化漆酶优良的载体。原子转移自由基聚合技术(ATRP)是近年来对材料进行功能化改性的主要方法之一，其与普通聚合反应相比，具有反应可控、适用单体范围广和生成的聚合物分子量分布窄等优点，已经在纤维的改性和修饰领域得到了很好的应用[13-15]。

本文以工业化生产的水刺粘胶纤维膜为基材，采用ATRP技术通过引发、接枝等步骤对其进行功能化修饰，接着通过吸附的Fe3+离子作为漆酶固定化的配合位点，该方法固定化漆酶不仅可以提高酶使用过程中的环境(温度、pH值)稳定性，而且具有较好的重复使用性能。

1 试验部分

1.1 材料与仪器

材料：四氢呋喃(THF)、三乙胺(TEA)、2-溴异丁酰溴(2-BIB)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、醋酸(CH3COOH)、醋酸钠(CH3COONa)、考马斯亮蓝G-250、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(HMTETA)、氯化亚铜(CuCl)、氯化铁(FeCl3)，均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水刺粘胶纤维膜(面密度为45 g/m2)，浙江金三发集团有限公司；漆酶(来自云芝，≥0.5 U/mg)，Sigma-Aldrich生物科技有限公司。

仪器：S-4800场发射扫描电子显微镜、扫描电子能谱仪，日本日立公司；IR Prestige-21傅里叶红外光谱仪，日本岛津公司；Lab2000真空手套箱，北京伊特克斯惰性气体系统有限公司；SHA-B恒温水浴振荡器，上海捷呈设备有限公司；UV-5500紫外-可见分光光度剂，上海元析仪器有限公司；THZ-82恒温摇床，江苏太仓市实验设备厂。

1.2 功能性水刺粘胶纤维膜的制备

1.2.1 引发反应

准确称取水刺粘胶纤维膜置于THF溶液中浸泡2 h进行除杂处理，接着将除杂后的水刺粘胶纤维膜放入70 μL TEA和63 μL 2-BIB和40 mL THF的混合液中，在35 ℃、120 r/min恒温水浴振荡器中进行引发反应，待反应4 h后用THF进行清洗，待用。

1.2.2 接枝反应

将24 mL的DMF和400 μL的HMTETA混合液(DMF/HMTETA)与HEMA分别进行冷冻脱氧处理后置于手套箱中，之后准确称取100 mg CuCl加入到DMF/HMTETA混合液中搅拌2 h，最后将HEMA和完成引发反应的水刺粘胶纤维膜同时加到DMF/HMTETA/CuCl混合液中，待反应结束后取出改性后的水刺粘胶纤维膜，并用去离子水多次清洗后真空干燥得到接枝HEMA的水刺粘胶纤维膜(SV-poly(HEMA))，反应示意图如图1所示。

图1 水刺粘胶纤维膜的ATRP接枝过程示意图Fig.1 Schematic diagram of ATRP grafting process of spunlaced viscose fiber membrane

1.2.3 Fe3+离子吸附

准确称取20 mg的SV-poly(HEMA)置于50 mL Fe3+离子(质量浓度为1.0 g/L)溶液的蓝盖瓶中，随后将蓝盖瓶放于恒温摇床(温度为25 ℃，转速为120 r/min)中24 h，最后将吸附Fe3+离子后的SV-poly(HEMA)取出，用蒸馏水充分洗涤、真空干燥后得到吸附Fe3+离子后的SV-Poly(HEMA) (SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ))。

1.3 纤维形态及结构表征

1.3.1 形貌观察与元素分析

将改性前后的水刺粘胶纤维膜经过喷金处理后，采用扫描电子显微镜、扫描电子能谱仪进行形貌表征和元素分析。

1.3.2 化学结构表征

分别将改性前后的水刺粘胶纤维膜剪碎成粉末状，采用傅里叶红外光谱仪通过溴化钾压片法确定其所含的官能团。

1.4 漆酶固定化量及活性测试

1.4.1 漆酶固定化过程

分别称取0.02 g SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)置于20 mL、1.0 g/L的漆酶溶液(缓冲液采用100 mmol/L、pH值为4.5的醋酸钠-醋酸溶液)中，于4 ℃、120 r/min摇床中进行酶的固定化12 h。待反应结束后，用缓冲液多次洗涤固定化酶的纤维膜，直至洗涤液中检测不到漆酶为止。

1.4.2 酶固定化量测定

采用Bradford方法测定SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)对漆酶的固定化量。利用紫外-可见分光光度计测量吸附前后及清洗固定化酶所用缓冲液中的漆酶溶液的含量。按照下式计算酶的固定化量：

式中：Ge为漆酶固定化量，mg/g；C0为反应前漆酶的质量浓度，mg/mL；C1为反应后漆酶的质量浓度，mg/mL；C2为冲洗液中漆酶的质量浓度，mg/mL；V0为实验所用酶溶液的体积，mL；V1为冲洗液的体积，mL；m为用于固定化酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)的质量，g。

1.4.3 酶活性的测定

采用ABTS作为漆酶的催化底物，测定游离漆酶与固定化漆酶反应前后ABTS溶液的吸光度变化，用于表征游离和固定化漆酶活性，根据下式计算酶活性：

式中：v为漆酶的活性，U；A0和A分别表示反应前后ABTS溶液的吸光度；V为ABTS溶液的体积，mL；T为实验反应时间，min；K为底物对应的常数；me为漆酶的质量，mg。

1.5 环境稳定性和重复使用性测试

1.5.1 漆酶活性的影响因素

为探究反应温度对游离和固定化漆酶的影响，分别将游离漆酶和固定化漆酶样品放于pH值为4.5的缓冲液中，在不同温度条件下用ABTS测定漆酶活性,并以最高活性为100%，得出其他温度下的相对活性。

为探究pH值对游离和固定化漆酶的影响，分别将游离漆酶和固定化漆酶样品放于不同pH值的缓冲液中，在各自最适温度下用ABTS测试漆酶活性，并以最高活性为100%，得出其他pH值下的相对活性。

1.5.2 固定化漆酶的重复使用性能

为测定固定化漆酶的重复使用性能，将已经固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)在最适pH值和温度下进行重复使用，以首次使用时酶活性为100%，测定每次重复使用后酶相对活性。

1.6 固定化漆酶的储存稳定性能测试

将同一批固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)和游离酶溶液置于4 ℃下储存，每隔2 d取出固定化漆酶的纤维膜和游离酶溶液进行酶活测试，通过比较漆酶相对活性的变化，研究漆酶的储存稳定性能。

2 结果与讨论

2.1 纤维形态结构分析

2.1.1 改性前后纤维膜的表面形貌分析

改性前后的水刺粘胶纤维膜和SV-Poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)表面形貌变化如图2所示。

图2 水刺粘胶纤维膜的扫描电镜照片(×400)Fig.2 SEM images of spunlaced viscose fiber membrane(a), SV-poly(HEMA) (b) and SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ) (c) (×400)

由图2可以看出：水刺粘胶纤维膜表面光滑，分布较为均匀，经过ATRP改性后的水刺粘胶纤维膜由于功能性分子链的存在，纤维直径和粗糙度略微增加，依然保持着良好的纤维形态；经过金属离子吸附后的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)相较于SV-poly(HEMA)纤维形态和纤维直径几乎没任何变化，原因是吸附的Fe3+离子的半径远小于接枝的功能性分子链的长度，对纤维的形态结构影响较小。

2.1.2 元素分析

引发反应前后水刺粘胶纤维膜的元素分析结果如表1所示。可看出，水刺粘胶纤维膜主要含有C和 O这2种元素；通过引发反应后的水刺粘胶纤维膜含有C、O和Br 3种元素，说明已成功地对水刺粘胶纤维膜进行了引发反应，引入了Br原子。

表1 元素种类及其质量分数Tab.1 Element types and its weight percentages

2.1.3 化学结构分析

图3 接枝改性前后水刺粘胶纤维膜的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrum of spunlaced viscose fiber membrane and SV-poly(HEMA)

2.2 漆酶固定化量分析

图4示出接枝时间为0、2、4、5和6 h时用于配位法固定化酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)对漆酶的固定化量。可看出，随着接枝处理时间的延长，漆酶的固定量呈现出先上升后下降的趋势，原因是在反应初期，随着接枝时间的延长纤维上的功能性基团大量增加，其对漆酶的固定化量表现出快速上升的趋势；当接枝时间从2 h延长到4 h时，纤维上供功能性基团结合的位点逐渐减少，但依然能够结合新的功能性基团，表现出对漆酶的吸附量继续增加，但速率有所减缓，且在4 h时其吸附量达到最大值，为132.9 mg/g；当接枝时间进一步延长时，纤维上功能性基团的配合位点达到饱和，继续增加的官能团在减少纤维比表面积的同时伴随着副反应的产生，占据了之前接枝的功能性基团，使得其对漆酶的固定化量有所减少。

图4 水刺粘胶纤维膜对漆酶固定化量Fig.4 Immobilization laccase of spunlaced viscose fiber membrane with different modification time

2.3 固定化漆酶的性能分析

2.3.1 温度和pH值对漆酶固定化的影响

在不同温度和pH值条件下，测定游离漆酶和固定化漆酶的活性，结果如图5所示。

图5 温度与pH值对游离漆酶和固定化漆酶的影响Fig.5 Relationship of pH (a) and temperature (b) on free and immobilized laccase

由图5(a)可知，游离漆酶和固定化漆酶的最适pH值都是4.5。从整体而言，固定化漆酶与游离漆酶相比，对于pH值变化表现出更好的稳定性，这是因为载体的存在能更好地保证漆酶的空间结构,受pH值影响较小，提高其应对pH值变化的稳定性能。同理，在不同温度条件下，测定游离漆酶与固定化漆酶的相对活性，从图5(b)可看出，固定化漆酶的整体活性都较游离漆酶有所提升，同时固定化酶的最适温度也相较于游离酶有所提高，从50 ℃上升至55 ℃，表明固定化漆酶对较高的温度表现出更好的稳定性。

2.3.2 固定化漆酶的重复使用性能

重复使用性能是决定漆酶能否被广泛应用的主要因素之一，也是表征漆酶固定化稳定性能的关键因素，本文对固定化漆酶的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)进行了10次重复使用，结果如图6所示。可看出，固定化漆酶在最适pH值和温度下，随着使用次数的增加，漆酶的催化降解性能有所降低，原因是固定化漆酶在催化降解和清洗过程中，部分固定化漆酶的活性下降或脱落所致。经过10次重复使用后，固定化漆酶仍保留较高的活性，为其初始活性的55%以上，表明SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)固定化漆酶具有良好的重复使用性能。

图6 固定化漆酶的重复使用性能Fig.6 Reusability of immobilized laccase

2.3.3 固定化漆酶的储存稳定性能

固定化漆酶和游离酶储存稳定性能测试结果如图7所示。

图7 漆酶的储存稳定性能Fig.7 Storage stability of free and immobilized laccase

由图7可看出，存储19 d后，固定化漆酶的活性相较于游离漆酶有很大的提升，从21%增加到57.9%，说明本文研究所制备的功能性复合纤维膜对酶的存储性能得到很好地改善，这将对漆酶的广泛应用有非常重要的意义。

3 结 论

本文通过原子转移自由基聚合技术对水刺粘胶纤维膜进行接枝改性，赋予其特殊的功能性官能团，并对改性后的功能性水刺粘胶纤维膜进行Fe3+离子吸附，得到的SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)可作为配位法固定化酶的载体。当接枝时间为4 h时，SV-poly(HEMA)-Fe(Ⅲ)对漆酶的固定化量达到132.9 mg/g；相比于游离漆酶而言，固定的漆酶有效地降低了其对环境(pH值、温度)变化的敏感性；对其进行10次重复使用后，固定化漆酶活性依然保持着55%以上，表现出良好的重复使用性能，为漆酶的进一步应用提供了一个有效的方法。

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