巴拉圭茶对高脂膳食小鼠氧化还原状态的影响

李翔辉，刘瑞霞，赵俊芳，张媛媛，王 娇

（漯河食品职业学院，河南漯河 462300）

改革开放以来，我国居民生活水平逐年提高，膳食结构发生较大变化。统计发现，1982~2012 年我国居民碳水化合物供能比例呈下降趋势，脂肪供能呈上升趋势，已超出中国居民膳食指南推荐值[1−2]，长期过多的脂肪摄入会导致机体氧化还原状态失衡，产生过量的活性氧自由基，造成氧化应激，诱发肥胖、脂类代谢紊乱，心血管疾病等各类慢性疾病[3−4]。目前研究已经明确，可以通过摄入适量的抗氧化剂来改善机体氧化还原状态。如陈丽梅等[5]研究表明抗氧化剂槲皮素可以调节高脂膳食小鼠肝脏组织氧化还原状态。Prior 等[6]发现，摄入外源性抗氧化剂可以帮助机体清除过量的活性氧自由基，增强抗氧化酶活性，降低脂质过氧化物。

巴拉圭茶（Ilex paraguariensis）是其树叶经过发酵、干燥、粉碎等工艺制成的一种茶，主要产于南美的阿根廷、巴西、智利、乌拉圭等国家。巴拉圭茶是深受人们喜爱的一种饮品，至今已有超过四百余年的历史。巴拉圭茶被称为茶主要因为它与中国的茶有着类似的冲泡方式，实际上两者是不同的植物，巴拉圭茶茶树属于冬青科冬青属植物，而茶树属于山茶科山茶属灌木。虽然两者是不同的植物，但是两者在化学成分、功能性作用、饮用方式等方面具有相似之处。巴拉圭茶的主要功能性成分为多酚类化合物，其根、茎、叶中都可以提取到多酚，其中叶子中含量最高，Zwyrzykowska 等[7]采用液相色谱-质谱联用，鉴定巴拉圭茶的甲醇水提物中多酚类物质，结果显示从提取物中鉴定出多达20 种多酚化合物，包括芦丁、奎尼酸及绿原酸等。巴拉圭茶除多酚类化合物外，还含有皂苷、黄嘌呤生物碱、维生素等活性成分，Mateos 等[8]采用液相色谱-质谱联用鉴定巴拉圭茶中甲基黄嘌呤的含量高达8.2~10.2 mg/g。已有研究表明，巴拉圭茶具有抗氧化、抗菌、抗癌、减肥、保护心血管等功效，如Daniel 等[9]发现巴拉圭茶体外抗氧化能力与其浓度呈正相关，Teselkin 等[10]发现健康志愿者饮用巴拉圭茶2 h 后，检测到其血浆中抗氧化能力相关指标有所提高，Colpo 等[11]选取经慢性固定应激诱导后的大鼠，给予适量马黛茶处理，各项检测指标显示马黛茶在一定程度上可以减弱脂质和蛋白质的氧化，显示马黛提取物对慢性固定应激大鼠的大脑具有抗氧化作用。Noureddine 等[12]对马黛水提物的抗菌活性研究显示马黛水提物对大多数菌株均有较强的抗菌活性，对革兰阳性菌的抗菌活性更强，Ronco 等[13]关于巴拉圭茶与乳腺癌患病风险的病例对照研究显示巴拉圭茶摄入量与患乳腺癌风险呈负相关。我国于2004 年把巴拉圭茶列入食品用香料名单，由于其具有多种功效，近年来逐渐被我国消费者接受，销量逐年增加，但目前关于巴拉圭茶的研究主要集中在活性成分鉴定、提取、降血脂、减肥等方面[14−16]，对其抗氧化活性的机制尚不完全明确，本课题拟通过给高脂膳食小鼠灌胃巴拉圭茶来探讨巴拉圭茶对小鼠肝脏抗氧化能力变化的影响，对肝脏FoxO3a基因通路的影响，探究其抗氧化活性机制，为进一步研究巴拉圭茶降血脂、减肥等功效与抗氧化之间的关系，以及开发有关功能食品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴拉圭茶 阿根廷克罗尼亚列比格公司；C57BL/6J 雄性小鼠SPF 级 河南斯克贝斯生物科技股份有限公司；基础日粮、高脂日粮（见表1） 河南斯克贝斯生物科技股份有限公司；活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（Glutathione/Oxidized glutathione，GSH/GSSG）比值、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；Trizol、引物、M-AMV 逆转录酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂 均为分析纯。

表1 饲料营养成分Table 1 Feed nutrient

Quant Studio1 实时荧光定量PCR 仪 美国ABI公司；UV2600 紫外可见分光光度计 日本岛津公司；BSA124S 电子分析天平 德国赛多利斯公司；CenLee 5R 离心机 湖南湘立科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 选取6 周龄C57BL/6J 雄性小鼠48 只，饲喂基础日粮预养一周后，随机分为四组：对照组（ND 组，基础日粮），高脂组（HF 组，高脂日粮），高脂+低剂量巴拉圭茶组（HFL 组，高脂日粮，按1 g/kg 剂量灌胃巴拉圭茶），高脂+高剂量巴拉圭茶组（HFH 组，高脂日粮，按2 g/kg 剂量灌胃巴拉圭茶）。巴拉圭茶组灌胃容量20 mL/kg，ND 组和HF 组按照等剂量的蒸馏水灌胃，每日一次，连续灌胃6 周，处死前测定小鼠体质量，期间自由摄食和饮水。

1.2.2 巴拉圭茶的制作 参考Pereira 等[17]制作方法，分别用20 mL 蒸馏水（90 ℃）冲泡5、10 g 巴拉圭干茶，3 min 之后过滤，重复上述操作5 次，5 次滤液共100 mL 混匀放置至室温备用, 茶液浓度为0.05、0.10 g/mL。每次灌胃均使用新鲜制作的茶液。

1.2.3 样品采集 连续灌胃6 周后，小鼠禁食12 h，断颈椎处死小鼠，迅速取出0.2 g 左右肝脏组织置于液氮速冻，转移至−70 ℃超低温冰箱中保存用于实时定量RT-PCR 实验，剩余肝脏组织按照比例称取肝脏组织和生理盐水（w:v=1:9）混合匀浆，以3000 r/min，4 ℃低温离心15 min，取上清液，置于−20 ℃环境中备用。

1.2.4 肝脏中氧化还原指标的测定 肝脏中ROS 水平、MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性、GSH-Px 活性、GSH/GSSG 比值、T-AOC 的测定严格按照试剂盒说明进行。

1.2.5 肝脏中mRNA 表达量的测定 Trizol 裂解法提取肝脏组织中总RNA，适量的DEPC 水稀释，分光光度计测定260 nm/280 nm 比值，反转录得到cDNA，将反转录得到cDNA 以β-actin 为内参基因，对目的基因进行RT-PCR 进行扩增，检查各模板的Ct 值，结果用2−△△Ct表示相对基因的表达量。引物序列见表2。

表2 基因的引物序列Table 2 Sequence of the primers

1.3 数据处理

使用SPSS 22.0 软件对试验数据进行处理，采用单因素方差分析，Duncan 检验进行多重比较，结果用±s 表示，P＜0.01 表示差异极显著；P＜0.05 表示差异显著。采用Pearson 相关系数分析两变量之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠体质量的影响

由表3 可知，饲喂高脂日粮的HF 组小鼠体质量显著高于对照组小鼠体质量（P＜0.05），灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠体质量均显著低于饲喂高脂日粮的HF 组小鼠体质量（P＜0.05），灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠体质量与对照组小鼠体质量无显著差异（P>0.05）。C57BL/6J 品系小鼠具有对膳食脂肪更强的敏感性，高脂膳食条件下更容易导致肥胖，与人体肥胖的发生与发展具有相似性[18]。Uecker 等[19]在巴拉圭茶对高脂膳食大鼠体重变化影响的研究中发现，经过34 d 喂养，高脂膳食组大鼠体重增加量明显高于正常日粮组，而巴拉圭茶高脂膳食组大鼠体重增加量显著低于高脂膳食组。高脂膳食小鼠由于脂肪能量摄入过多，无法及时消耗，造成脂肪堆积，体重增加，巴拉圭茶能够降低高脂膳食小鼠体重，可能是因为其提高了高脂膳食小鼠能量消耗，减少了脂肪堆积量。

表3 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠体质量的影响Table 3 Effects ofIlex paraguariensison body weight of high fat diet fed mice

2.2 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏ROS 水平的影响

从图1 可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏ROS 水平显著升高（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠肝脏ROS 水平显著降低（P＜0.05）。上述结果说明长期的高脂膳食会造成小鼠肝脏ROS水平升高，机体氧化还原状态失衡，通过灌胃不同剂量的巴拉圭茶，可以显著降低ROS 累积量，使机体恢复氧化还原状态的平衡。ROS 是反映机体氧化还原状态的重要指标，当机体的ROS 生成速率超过抗氧化防御系统的清除速率时，会使ROS 累积量维持在一个较高水平，导致机体出现严重的氧化应激[20]。李龙囡等[21]在抗氧化剂硫辛酸对高脂膳食小鼠脂类代谢的研究中也发现高脂膳食会造成小鼠肝脏ROS水平显著提高，其原因在于脂类代谢伴随ROS 的产生，长期高脂膳食会导致过量的ROS 得不到及时清除，在体内累积造成机体氧化还原状态失衡。由于多酚类化合物含有一个或多个羟基基团的苯环结构，具有捕捉活性氧自由基的功能，能够降低体内过量自由基，通过灌胃富含多酚类化合物的巴拉圭茶后，ROS水平显著降低，可能是多酚类化合物在起作用。

图1 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏活性氧自由基水平的影响Fig.1 Effects ofIlex paraguariensison liver ROS levels of high-fat diet fed mice

2.3 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏中MDA 含量的影响

从图2 可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏MDA含量显著升高（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH组小鼠肝脏MDA 含量显著降低（P＜0.05）。上述结果表明，长期高脂膳食会造成小鼠肝脏MDA 含量升高，巴拉圭茶可以有效降低MDA 含量，且具有一定的剂量效应。MDA 的产生是由于过量ROS 攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引起的脂质过氧化作用造成的，其含量的多少可反映组织细胞的脂质过氧化速率或强度[22]。由于高脂膳食造成小鼠ROS 水平明显增加，过量的ROS 没有得以及时清除，攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化产生过量的MDA，结合ROS 试验结果来看，巴拉圭茶干预的小鼠ROS 水平降低，MDA 含量也降低，也进一步反映了ROS 与MDA 之间的关系，这说明巴拉圭茶可以降低组织细胞受自由基攻击的程度，这与巴拉圭茶改善机体氧化还原状态有一定关系。Brasilino 等[23]研究发现每天给予受到氧化应激小鼠20 mg/kg 巴拉圭茶，28 d 后检测到其血浆中MDA 含量与对照组相比明显下降。

图2 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏中MDA含量的影响Fig.2 Effects ofIlex paraguariensison content of MDA in liver of high-fat diet fed mice

2.4 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响

从图3 可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px 活性显著降低（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px 活性显著提高（P＜0.05）。上述结果表明，长期高脂膳食会造成小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px 活性降低，灌胃巴拉圭茶可以有效提高CAT、SOD、GSH-Px 活性，且具有一定的剂量效应。机体在代谢过程中会产生ROS，也会清除ROS，使之处于动态平衡的状态。机体自身的防御体系负责清除ROS，包括酶促和非酶促两个体系，酶促系统包括CAT、SOD、GSH-Px等。CAT 就是被细胞用来催化过氧化氢分解的工具，能够催化机体代谢过程中产生的过氧化氢，生成无害的水和氧气，避免过氧化氢对机体造成损害[24]。SOD 是抵御活性氧损伤的第一道防线，它能降低过高浓度的活性氧物质，保护细胞免受损伤[25]。GSHPx 在机体中能够催化过氧化物分解，并且能特异催化GSH 对氢过氧化物的反应，以及和其他抗氧化酶协同作用清除多余的ROS 使得ROS 处于正常生理范围内[26]。从试验结果来看，高脂膳食造成小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px 活性降低，负责清除ROS的酶促体系受到影响，进而影响小鼠的氧化还原状态，而灌胃巴拉圭茶能够显著恢复高脂膳食小鼠酶促体系中三种酶的活性，这有利于机体清除过量的ROS，保持机体氧化还原状态平衡。Pereira 等[17]给予大鼠20 mg/kg 剂量的巴拉圭茶，检测发现巴拉圭茶能够增加肝脏中CAT、SOD、GSH-Px 的活性，Bremer 等[27]通过与对照组相比，摄入200 mL 巴拉圭茶的志愿者血浆中CAT 活性增加28.7%，SOD 活性增加21.3%，GSH-Px 活性增加9.6%，这些结果都表明巴拉圭茶可以在一定程度上提高机体抗氧化酶活性，发挥抗氧化作用。

图3 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px活性的影响Fig.3 Effects ofIlex paraguariensison the activity of CAT,SOD,GSH-Px in liver of high-fat diet fed mice

2.5 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏GSH/GSSG 比值的影响

从图4 可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏GSH/GSSG 比值显著降低（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠肝脏GSH/GSSG 比值显著提高（P＜0.05）。上述结果表明，长期高脂膳食会造成小鼠肝脏GSH/GSSG 比值降低，灌胃巴拉圭茶可以有效提高GSH/GSSG 比值。还原型谷胱甘肽（GSH）广泛地存在于活体细胞中，可与ROS 结合，自身被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSG），加速ROS 的排泄，减轻ROS 对机体的损伤[28]。正常情况下，机体中的GSH/GSSG 比值处于一定水平，当机体受到高脂膳食影响，机体处于氧化应激状态，GSH 被氧化成GSSG，造成GSH/GSSG 比值下降。高脂组小鼠膳食脂肪代谢产生过多的ROS，GSH 与ROS 结合后，其被氧化为GSSG，导致GSH/GSSG 比值降低，这可能是HF 组小鼠肝脏GSH/GSSG 比值显著降低的原因。巴拉圭茶的干预后，HFL 组和HFH 组小鼠肝脏GSH/GSSG 比值提高，可能是由于抗氧化酶活性的提高，ROS 水平降低，GSH 与ROS 结合被氧化成GSSG 的反应减少，最终相比HF 组GSH/GSSG 比值有所提高。Silva 等[29]研究巴拉圭茶对高脂膳食大鼠海马和肝脏组织氧化还原状态中发现，高脂膳食造成肝脏组织中GSH 含量下降，巴拉圭茶高脂组肝脏组织中GSH 含量有所升高，这也说明了巴拉圭茶的抗氧化作用与GSH 有一定的关系。

图4 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏GSH/GSSG 比值的影响Fig.4 Effects ofIlex paraguariensison liver GSH/GSSG of high-fat diet fed mice

2.6 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏T-AOC 的影响

T-AOC 反应机体酶促和非酶促两个自身防御体系抗氧化物质的总体水平，是反映机体抗氧化能力最全面的指标之一，能全面衡量机体氧化还原状态[30]。从图5 可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏T-AOC显著降低（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠肝脏T-AOC 显著提高（P＜0.05）。结合巴拉圭茶对酶促反应体系中抗氧化酶活性的影响以及对非酶促反应体系中GSH/GSSG 比值的影响来看，相比ND 组，HF 组T-AOC 下降可能是由于抗氧化酶活性降低、GSH/GSSG 比值下降两方面原因造成的，巴拉圭茶干预后，抗氧化酶活性、GSH/GSSG 比值均有所恢复，进而T-AOC 有所提高，这说明巴拉圭茶对提高机体抗氧化防御体系能力有一定作用。

图5 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏T-AOC 的影响Fig.5 Effects ofIlex paraguariensison liver T-AOC of high fat diet fed mice

2.7 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达的的影响

FoxO3a是人类叉头框O （forkhead box O, FOXO）蛋白家族的一个重要成员，在细胞增殖、分化、代谢，改善氧化应激，延长寿命等方面具有重要意义[31]。catalase和MnSOD是FoxO3a的下游基因。从图6可知，与ND 组相比，HF 组小鼠肝脏FoxO3a及下游catalase和MnSOD基因表达量显著下降（P＜0.05）；与HF 组相比，灌胃低剂量巴拉圭茶的HFL 组和灌胃高剂量巴拉圭茶的HFH 组小鼠肝脏FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量显著提高（P＜0.05）。FoxO3a被激活后可诱导下游抗氧化基因表达，发挥生物学作用[32]。FoxO3a被激活后，可以上调catalase基因表达，可以增加CAT 的表达，CAT 能够作用于过氧化氢使其分解为水和氧气，进而改善机体氧化还原状态[33−34]。Callaway 等[35]研究发现当FoxO3a转录活性受到抑制时，MnSOD的表达减少，这说明FoxO3a可以调控MnSOD的表达。本研究中，两种剂量的巴拉圭茶均可显著（P＜0.05）上调高脂膳食小鼠肝脏FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达，CAT、SOD 活性也得到显著（P＜0.05）增加。CAT 活性增加有助于机体中过氧化氢的分解，SOD 活性增加能降低过高浓度的活性氧物质，保护细胞免受损伤。这一结果和上述研究类似，说明巴拉圭茶可以通过激活FoxO3a基因通路，上调catalase、MnSOD基因表达，提高CAT、SOD 活性，改善机体氧化还原状态。Shalini 等[36]研究发现当小鼠肝脏细胞中的FoxO3a的活性被抑制时，会导致机体的GSH-Px、SOD 表达减少，ROS 无法有效清除，机体的抗氧化能力减弱，氧化还原状态失衡，这说明FoxO3a基因通路在调节机体抗氧化酶上具有一定作用。根据上述结果推测，巴拉圭茶改善高脂膳食造成的机体氧化还原状态失衡状态的原因可能是通过上调高脂膳食小鼠肝脏FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达，提高机体CAT、SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活性来实现的。

图6 巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达的影响Fig.6 Effects ofIlex paraguariensison liverFoxO3a, catalaseandMnSODgene expression in mice fed with high-fat diet

2.8 小鼠肝脏氧化还原与抗氧化基因相关性分析

通过对小鼠肝脏氧化还原指标与抗氧化基因表达的相关性分析，结果显示，两者具有显著相关性（表4）。ROS 与FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量呈极显著负相关（P＜0.01），CAT、SOD、GSHPx 与FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量呈极显著正相关（P＜0.01），结合基因表达量和抗氧化酶活性、ROS 水平等试验结果数据，可以推测，巴拉圭茶可能是通过调控FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量，影响机体酶促反应中抗氧化酶活性，进而调节机体ROS 水平，影响机体氧化还原状态。

表4 肝脏氧化还原指标与FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达的相关性分析Table 4 The correlation between hepatic redox indes and theFoxO3a,catalaseandMnSODgene expression

3 结论

本课题研究了巴拉圭茶对高脂膳食小鼠肝脏氧化还原状态的改善作用，结果表明，巴拉圭茶可降低高脂膳食小鼠肝脏中ROS 水平、MDA 含量，可增加酶促反应体系SOD、CAT、GSH-Px 抗氧化酶的活性，可增加T-AOC 水平、GSH/GSSG 比值，可以上调FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量，并且具有一定的剂量关系，相关性分析显示FoxO3a、catalase、MnSOD基因表达量与SOD、CAT、GSH-Px 抗氧化酶的活性呈正相关，与ROS 水平呈负相关，说明巴拉圭茶对改善高脂膳食造成小鼠肝脏氧化还原状态失衡的现象具有积极的作用，此作用可能与巴拉圭茶上调FoxO3a基因通路基因表达量，提高机体抗氧化酶活性，机体过量的ROS 得以及时清除有一定关系。本研究结果为开发有关巴拉圭茶的功能性食品提供了一定的理论依据。