樱桃果园生草对土壤微生态的影响

赵柏霞，闫建芳，潘凤荣

(1.大连市农业科学研究院，辽宁 大连 116036；2.大连民族大学，辽宁 大连 116600)

【研究意义】大连市依托其得天独厚的地理位置和气候条件，作为中国为数不多甜樱桃(Cerasusavium)适栽区之一，栽培历史悠久。近年来，在樱桃栽培面积迅速增加，产业规模不断扩大的同时，果园土壤肥力下降、水土流失等问题也逐渐显现出来[1]。果园生草栽培在19世纪始于西方发达国家，近些年，在诸多发达国家已经得到了广泛的运用，据报道，55%～70%的果园都采用了生草栽培模式，有的国家甚至达到95%左右。我国从20世纪80、90年代才开始推行果园生草模式，目前的普及率仅有10%左右[2-3]。果园生草具有改善土壤的物理性状、降低土壤容重[4-5]、增加土壤渗水性和持水能力[6-7]、提高土壤肥力[8-10]、调节果树根系周围的温湿度等作用[11-12]。【前人研究进展】近年来，我国科研工作者在果园生草方面做了大量的工作，主要集中在苹果园、橘园、梨园等，研究方向主要是果园土壤理化性质和土壤肥力[13-15]、微生物群落变化[16-17]、果实品质[18-19]、草种选择[20-21]、叶片特性[22-23]等方面。目前，关于在樱桃果园进行生草栽培研究则较少，李芳东等[24]研究发现，甜樱桃果园生草可以降低0～30 cm土壤日最高温度和昼夜温差，增大土壤含水量，谷岩[8]研究发现，甜樱桃园间作紫花苜蓿可以有效提高土壤有效养分含量，增加团粒结构，使土壤肥力显著提高。但是，甜樱桃果园行间生草对土壤微生物群落动态的影响鲜有报道。【本研究切入点】本试验在甜樱桃果园行间种植鼠茅草(Vulpiamyuros)、黑麦草(Loliumperenne)、铺设园艺地布，并以清耕为对照，开展不同处理方式对土壤养分和细菌群落特性影响的研究。【拟解决的关键问题】探明甜樱桃果园生草后土壤养分结构和细菌群落结构的变化，筛选出适宜种植的生草品种，以期为甜樱桃果园生草栽培奠定基础，为构建合理的甜樱桃果园土壤管理模式提供理论依据，推动果园种植业的绿色健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验樱桃园位于辽宁省大连市甘井子区大连农科院樱桃园，该园地位于121° E，39° N，属暖温带半湿润大陆性季风气候，年平均气温10 ℃，年降雨量550～800 mm，无霜期180～200 d，年平均日照时数2500～2800 h。地块平整，土壤为砂壤土。2013年建园，株行距3.0 m×4.0 m。

1.2 试验设计

2018年9月开始播种试验，采取果树行间种草，条播种植。果树株行距为4 m×3 m，试验设种植鼠茅草(S)、种植黑麦草(H)、铺设园艺地布(D)和清耕对照(Q)4个处理，每个处理设3次重复，每个处理小区面积为100 m2，共12个处理小区。各处理管理措施基本一致，常规管理。

1.3 土壤温湿度测定

试验与2020年4—7月进行，使用土壤温湿度记录仪(型号为T2S-2X，浙江托普云科技有限公司生产)测定土壤的温度、水分。分别在4月和7月两次测定土壤的温湿度。

1.4 样品采集

2020年6月下旬在各处理小区按5点法采集土壤样品，清除表层凋落物后，采集取5～15 cm 土层土样，带回实验室，将每个处理的土样充分混匀、去除根系等杂质后分成2份，1份干冰保存用于微生物群落测定，另一份自然风干，过60目筛后用于土壤理化性质测定。

1.5 土壤理化性质测定

采用重铬酸钾容量法—外加热法测定有机质含量，采用凯氏定氮法测定土壤全氮含量，采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定有效磷含量，采用醋酸铵浸提—原子吸收分光光度计(火焰)法测定速效钾含量[25]。

1.6 土壤微生物多样性测定

1.6.1 测序处理 此部分试验由北京百迈客生物科技有限公司完成。采用DNA提取试剂盒PowerSoil®DNA Isolation kit提取土壤样品基因组DNA。以此为模板，根据16S 全长引物27F 和1492R，合成带有Barcode 的特异引物，进行PCR 扩增。PCR产物根据电泳结果用ImageJ软件)定量，经过混样、纯化后使用PacBio 测序平台进行测序。

1.6.2 信息分析处理 对原始数据中导出 CCS 序列，进行 Barcode 识别，长度过滤，去除嵌合体，得到 Optimization-CCS；将 Optimization-CCS 序列进行聚类，将97%一致的序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)，并根据OTU的序列组成得到其物种分类。基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析和Alpha多样性指数分析；使用QIIME软件进行 Beta 多样性(Beta diversity)分析，通过NMDS分析、样品聚类热图及样品PCA、PCoA图比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。并通过组间差异显著性分析在不同组间寻找具有统计学差异的 Biomarker。

2 结果与分析

2.1 不同生草处理对土壤温湿度日变化的影响

在春季，与清耕相比，生草及覆盖地布对土壤温度、湿度都有一定的增加作用。生草区域的土壤温湿度均高于清耕对照，土壤最高温分别增加15.4% 和23.2%，土壤最高湿度分别增加24.1% 和23.9%。鼠茅草和黑麦草对土壤增温的效应相差不多。种植鼠茅草和黑麦草区域土层达到最高温的时间滞后于清耕对照区2～4 h(图1)。

图1 生草对土壤温湿度的影响(春季)

在夏季，生草和覆盖地布处理则都降低了土壤温度(图2)，提高了土壤湿度，降温提湿效果顺序为鼠茅草>黑麦草>地布。种植鼠茅草区域的土壤最高温度比对照降低了5.9%，土壤湿度则比对照提高了43.7%。究其原因可能是由于生草和覆盖阻挡了土壤与外界之间的能量交换，阻挡了水分的蒸发，因而影响了土壤的温湿度。

图2 生草对土壤温湿度的影响(夏季)

2.2 不同生草处理对土壤理化性质的影响

由表1可以看出，生草和铺设园艺地布处理后的pH均有所提高，其中鼠茅草和黑麦草处理的pH显著高于清耕对照和地布覆盖。生草处理的土壤养分含量高于地布覆盖和清耕处理，土壤的全氮、速效钾、有效磷以及有机质含量与清耕相比差异显著，但是鼠茅草、黑麦草处理的土壤养分含量没有明显差异。全氮和有效磷含量中，园艺地布处理均低于清耕对照。可见，生草栽培能在一定程度上提高樱桃果园土壤的有机质、氮、磷、钾含量。而铺设园艺地布提高速效钾、有机质的含量，降低土壤中全氮、有效磷的含量。

表1 不同处理对土壤理化性质的影响

2.3 生草对土壤微生物群落的影响

2.3.1 多样性指数和OTU丰度 4组样品测序后通过Barcode识别，共获得223 507条CCS序列(Circular Consensus Sequencing)，通过长度过滤、去除嵌合体后获得219 858条有效序列，鼠茅草、黑麦草、园艺地布及清耕的有效序列分别为12 506、9686、12 213和9565。使用Mothur软件，对样品Alpha多样性指数进行评估(表2)。所有序列按97%的相似度进行OTU分类，共得到2203个OTUs，其中鼠茅草OTUs数目最高，其次是园艺地布，清耕处理的OTUs数目最低。Shanon、Chao 1及ACE指数呈现出相似的变化趋势，即，鼠茅草>黑麦草>清耕>园艺地布，说明鼠茅草处理的样品中细菌的多样性和丰富度最高，其次是黑麦草，园艺地布处理的最低。

表2 各组样品OTU数目及多样性指数

由图3 可看出，各处理的稀释曲线末端基本趋于平缓，表明测序基本饱和，说明取样基本合理，能够较为真实地体现样品的微生物群落结构组成。尽管会忽略样品中某些含量较少的微生物群落，但样品中主要优势的微生物均已得到分析。

图3 土壤样品的稀释曲线

2.3.2 不同生草处理土壤细菌类群组成 本研究获得的微生物序列可分21个门，39个纲，85个目，119个科，221个属，263个种。基于OTU分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图。如图4所示，在已分类的门中，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetota)、放线菌门(Actinobacteria)的丰度较高。各样品中细菌门类组成基本一致，其中变形菌门是各个处理样品中最优势的类群。黑麦草样地中变形菌门相对丰度最高，为39.64%，鼠茅草、园艺地布及清耕样地中分别为29.21%、32.78%及34.08%。酸杆菌门在鼠茅草样地中相对丰度最高，为19.64%，其他3个样地中丰度差异不明显。

图4 4个处理土壤细菌在门、属水平的分布

对属水平丰度分析发现，鼠茅草样地中Vicinamibacter属和Brevitalea属相对丰度最高，分别为8.89%、5.46%；这2个属在黑麦草样地中丰度分别为6.49%、3.27%，在园艺地布样地中丰度为5.56%、2.92%；在清耕样地中丰度为6.33%、4.18%。在清耕样地中Sphingomonas属的丰度为4.83%，是4组样品中最高的，而鼠茅草样地中Sphingomonas属丰度仅为1.83%。以上结果显示，在细菌不同分类等级水平上，鼠茅草处理与其他3个处理样地均呈现出了较大的差异。

2.3.3 不同生草处理间细菌群落关系 用非度量多维标定法(Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，NMDS)对各处理所包含的物种信息进行分析，基于OTU水平的NMDS分析结果(图5)显示，Q和 D组中的点较分散，说明取样时造成了重复之间的误差，但是胁强系数为0.1262，说明该NMDS分析具有一定的可靠性，可以解释各样品中的细菌群落结构。代表鼠茅草和黑麦草样品的点距离较近，说明这两组样品中所含的细菌群落较相似，与园艺地布覆盖和清耕样地里的所含的细菌群落差异较大。

图5 各样品的NMDS分析图

为了进一步分析寻找各组样品之间具有统计学差异的物种，对供试样品进行了Line Discriminant Analysis Effect Size(LEfSe)分析(图6)。在鼠茅草样品中丰度显著高于清耕样品的细菌主要是Acidobacteria门细菌，主要是Vicinamibacteraceae、Vicinamibacter、Silvestris。而清耕样品中Sphingomonas、Sphingomonadaceae、Sphingomonadales、Alphaproteobacteria 细菌则显著高于鼠茅草样品。

图6 各样品细菌差异LEfSe分析

另外，对黑麦草和清耕样品进行LEfSe比较分析发现，Gammaproteobacteria纲中Burkholderiales 目细菌丰度明显高于清耕样品。鼠茅草和黑麦草样品对比，鼠茅草样品中Actinobacteria的细菌丰度具有显著优势，而黑麦草样品中Gammaproteobacteria纲样品则丰度较高。

由此可见，樱桃果园内生草能明显改变土壤中细菌群落和优势种群。而这些细菌种群的变化，则会在一定程度上影响果园土壤的理化性质。

3 讨 论

果园生草后可以调节果园温湿度、改善土壤理化性质，在行间生草后，改变了果园小气候环境，土壤和近地层的光、热、水、气等生态因子都发生了一定的变化，形成了有利于果树生长发育的微域下气候环境，为果树生长发育创造良好的环境条件。而对于果园微环境具体的影响程度则取决于生草的种类。本研究以种植鼠茅草、黑麦草、铺设园艺地布以及清耕的樱桃果园土壤为研究对象，研究了不同处理情况下土壤温湿度、理化性质变化情况。结果表明，樱桃果园生草区域在春季提高了土壤温湿度，而在夏季，生草处理则降低了土壤温度，提高了土壤湿度。这一结果与相关学者的报道相一致，李国怀等[26]和梅立新等[27]研究发现生草具有提高土壤含水量、调节地温的作用。李祥彬[28]研究发现蜜柚果园人工种草后，改善了土壤的团粒结构，增加了土壤的渗水性和持水能力，进而增加了土壤含水量。通过果园生草可以避免因温度过高影响果实生长和日灼，还可以避免因为温度过低造成果树冻害、抽条、霜冻等。

土壤pH是土壤的酸碱度，可以影响土壤性质和肥力，进而直接或间接影响植物的生长。在本试验中，土壤pH为弱酸性，生草可以提高土壤的pH，蒋小军[29]、黄毅斌[30]、段舜山[31]等的研究结果为生草能够提高南方酸性土壤的pH，这个结果与本文的试验结果相一致，都是提高了酸性土壤的pH。而朱先波等[32]研究发现，黑麦草可以降低猕猴桃果园碱性土壤的pH，安建军[33]研究报道，在大樱桃果园种植10种草种，均降低了碱性土壤的pH，综上结果说明果园生草可以调节土壤的酸碱度，使其向pH中性方向发展。

氮、磷、钾是果树生长发育必须的营养元素，也是土壤肥力的物质基础，其含量及存在状态，影响着果树的生长发育、产量和果实品质。在本试验中，各生草处理区与清耕对照区相比，生草栽培能在一定程度上提高樱桃果园土壤的有机质、氮、磷、钾含量，鼠茅草和黑麦草的效果差异不显著。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成成分，它在调节土壤养分循环和能量流方面发挥着重要作用。本文通过高通量测序技术分析显示，樱桃果园土壤中优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等。生草后明显的改变了土壤细菌群落结构，多样性指数分析表明，种植鼠茅草后，土壤中细菌的丰富度和多样性显著提高，OTU数量明显增加。这主要是因为生草后，大大提高了土壤中的养分含量，为微生物提供了丰富的碳源、氮源和其它所需养分，有利于微生物的生长繁殖。种植鼠茅草后，降低了土壤中Proteobacteria的丰度，而Acidobacteria细菌的丰度呈现上升趋势，在属水平上，Vicinamibacter和Brevitalea的丰度明显增加，Sphingomonas的丰度呈现降低趋势。魏倩倩等[34]研究发现，苹果园中种植白三叶后明显的改善了土壤微生物群落，微生物多样性显著增加。姜莉莉等[35]研究报道，在苹果园行间种植鼠茅草处理的土壤细菌OTU、Chao1、ACE 和Shannon 指数均低于其他处理，表明其细菌群落丰度和多样性较低，种植黑麦草处理后，土壤中的土壤鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)含量较高，本试验测定发现樱桃果园行间种植鼠茅草后土壤细菌多样性升高，而种植黑麦草后，土壤中Terrimonas属的细菌丰度升高，这个结果与本试验结果不同，其具体原因有待进一步深入研究。

4 结 论

本研究测定了大连地区樱桃果园行间生草后土壤温湿度、理化性质变化，并采用高通量测序技术研究了细菌群落组成及变化。结果显示，行间生草后，春季可以提高土壤温湿度，夏季则降低了土壤温度，提高了土壤湿度；土壤的有机质、氮、磷、钾含量均显著高于对照；土壤细菌优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、放线菌门，生草后土壤中细菌多样性和丰富度提高，种植鼠茅草后使酸杆菌门细菌丰度增加，种植黑麦草则富集了γ-proteobacteria纲细菌。