肺炎克雷伯氏菌环境菌株血清型及对玉米的致病性测定*

原小迪，李 钰，陈艳芳，李 晶，邵 婷，王 婷，虞林峰，黄 敏

(昆明学院 农学与生命科学学院，云南省高校都市型现代农业工程研究中心，云南 昆明 650214)

玉米是中国重要的粮食作物。近年来，各地玉米病害频发，严重影响了玉米的产量及品质。一种新病害——玉米细菌性顶腐病也在云南省各玉米栽培区广泛发生。该病在玉米抽雄前均可发生，造成玉米叶缘缺刻和叶片撕裂等典型症状，严重时不能结实[1]。该病具有分布广、症状多样和发病重的特点，一旦发生，便大范围传播，给玉米生产带来严重的损失。玉米细菌性顶腐病的病原为人和动物的条件致病菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae，KP)[1]。KP 在自然条件下还可导致香蕉叶斑病[2]，人工接种能使高粱产生叶斑及心叶不能展开等症状[3]。

临床上，KP 是引起医院内及社区感染的重要致病菌[4]，能引起肺炎、肝脓肿、脑膜炎、子宫炎、乳腺炎和肠炎等疾病[5]，常通过接触被污染的日用品、医疗器械或留置导管等引发，对医院重症患者或免疫力低的人群威胁较大[6]。KP 还具有多重抗生素抗性和耐药机制[7]，对环境的适应性和对不利条件的抵抗力都很强。随着抗菌药物的滥用，其危害性加剧。此外，KP 还能侵染鱼、兔和牛等动物[8-10]，对养殖业和从业人员的健康存在潜在威胁。除了最主要的毒力因子荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)外[5]，Ⅰ型和Ⅲ型菌毛、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、铁载体、孔蛋白、外排泵以及与尿囊素代谢有关的基因等在KP 对人和动物的致病性上都发挥着重要作用[11-12]。CPS 能使KP 在菌体表面聚集成复合物(荚膜)，在感染过程中使其顺利地在血液中蔓延，成功地避免吞噬作用，引起菌血症、脓血症和肺炎克雷伯氏菌性肺炎[6]。此外，CPS 耐干燥，可保持菌体表面湿润，有效预防菌体脱水死亡，这使具有荚膜的细菌更容易在宿主间相互传播[13]。荚膜的结构和抗原性与细菌的血清型密切相关[13]。KP 菌株分为82 个K 血清型[14]，临床上常见的主要有K1、K2、K5、K20、K54 和K57等[15]。其中，具有K1、K2、K54 和K57 血清型的菌株是强毒力菌株[15]。

KP 广泛分布于自然界，废水、污水、地表水、土壤、植物和零售肉类等都可能成为其非临床栖息地[3,16]。因其较强的环境适应性和跨界侵染特性，KP 能够随着被污染的农家肥、灌溉水、降雨、田间玉米顶腐病病残体或作为家畜饲料在植物与人和动物间传播，对人畜安全及玉米生产造成隐患。目前，虽已证实不同来源的KP(玉米顶腐病病原KpC4、临床R138、环境E4)菌株能够跨界侵染不同生物(动物和植物)[3]，但对于这些不同来源KP 菌株系统进化的关系研究仍然较少。本研究从环境中分离KP 菌株，并检测环境菌株对玉米的致病性及其与医院常见血清型的关联性，以期为玉米细菌性顶腐病病原学和流行学的研究以及制定玉米细菌性顶腐病的防控措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品和菌株

在昆明学院(N24.979°，E102.800°)校园环境中采集土壤及水样本，分离KP 环境菌株。以肺炎克雷伯氏菌RC4(具有500 μg/mL 利福平抗性的玉米细菌性顶腐病病原菌)、R138(具有K1 血清型和500 μg/mL 利福平抗性的临床菌株)和E4 菌株(具有K1 血清型的野生型环境菌株[3]，云南农业大学何月秋教授惠赠)为阳性对照。

1.2 试验方法

1.2.1 克雷伯氏菌的分离

本试验于昆明学院农学楼旁的大棚和露地玫瑰园等地取13 个土样，于听心湖湖水、聂耳广场、南门和博实楼附近的3 个池塘、地表积水和灌溉水等取19 个水样。取研磨后土样0.5 g 于20 mL 离心管中，加入无菌水5 mL 漩涡振荡；静置10 min，各取100 μL 分别涂布于MIAC(麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素培养基)和LB(Luria-Bertani)培养基。将采集的水样(1 mL)漩涡振荡，各取100 μL 分别涂布于MIAC 和LB 培养基。37 ℃倒置培养24 h，从MIAC 培养基上挑取大小及形态不同的单菌落在LB 培养基上划线培养，重复2～3 次得到单菌落。MIAC 培养基是高效的Klebsiella属分离培养基，Klebsiella属细菌可以发酵肌醇和阿东醇，且抗羧苄青霉素，因此，能在MIAC 培养基上生长的菌落可初步判定为Klebsiella[17]。以RC4 菌株为阳性对照。

1.2.2 肺炎克雷伯氏菌的鉴定

参照东秀珠等[18]的方法，对从MIAC 培养基上筛选得到的单菌落进行菌落形态观察和革兰氏染色，并进行丙二酸盐、酒石酸盐、V-P、乳糖、脲酶、精氨酸、葡萄糖、赖氨酸和明胶液化等生理生化指标的测定。参照说明书，用细菌基因组DNA 提取试剂盒(无锡百泰克生物技术有限公司)提取细菌DNA。使用16S rRNA 基因通用引物27F/1492R(表1)进行PCR 扩增。PCR 反应体系25 μL，包括：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足体系。以ddH2O 为空白对照。PCR 扩增的反应参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。取16S rRNA 基因扩增产物2 μL，用0.8% 琼脂糖凝胶电泳(100 V，40 min)检测。将条带长度与预计扩增产物长度基本相符的PCR 产物送至北京擎科新业生物技术有限公司昆明公司测序。测序结果在NCBI GenBank 中进行比对分析。通过MEGA 7.0 软件的最大似然法构建进化树(bootstrap runs=1 000)，确认该菌株的分类地位。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.3 肺炎克雷伯氏菌血清型鉴定

参照王建莉[15]的方法，使用表2 中引物，以KP 环境菌株基因组DNA 为底物进行PCR 扩增，反应体系25 μL，以ddH2O 为空白对照。反应条件见表3。每对引物PCR 扩增重复3 次。基因扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳(100 V，40 min)检测。

表2 扩增肺炎克雷伯氏菌血清型的引物Tab.2 Primers for identification of Klebsiella pneumoniae capsular serotype

表3 PCR 反应条件Tab.3 PCR reaction conditions

1.2.4 肺炎克雷伯氏菌致病性的测定

用针刺叶片和茎部以及棉签涂抹的方法，将鉴定为KP 的环境菌株菌悬液(1×108CFU/mL)接种至2～3 叶期、长势一致的健康玉米(糯玉米品种：白雪公主)植株；以LB 液体培养基为阴性对照，E4 和RC4 菌悬液为阳性对照。每个处理接种3 盆，每盆3 株。接种后置于光照培养箱(相对湿度60%～80%；光照10 h，28 ℃/黑暗14 h，23 ℃)中培养，每天观察并记录发病情况和发病率。玉米发病后取病健交界处进行病原物的分离和纯化。此试验根据柯赫氏法则重复3 次。

2 结果与分析

2.1 肺炎克雷伯氏菌环境菌株的分离

2.1.1 形态特征及生理生化鉴定结果

本试验在MIAC 平板上得到108 个单菌落。其中，分离自南苑大棚草莓土壤表面的E23 菌株菌落形态在MIAC(图1a)及LB(图1b)培养基上都表现出Klebsiella属的典型形态特征；染色镜检可见菌体在显微镜下呈红色短杆状，单个存在或2 个相连，为革兰氏阴性菌(图1c)。生理生化鉴定的12 项指标(表4)皆与玉米细菌性顶腐病病原菌KP RC4 菌株一致，与变栖克雷伯氏菌(K.variicola)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、植生克雷伯氏菌(K.planticola)的生理生化特性存在差异。

表4 E23 的生理生化鉴定结果Tab.4 Physiological and biochemical identification results of E23

图1 E23 的菌落形态和革兰氏染色图Fig.1 Colony morphology of E23 and microscopic examination of Gram staining

2.1.2 基于16S rRNA 基因的系统发育分析

由图2 可知：在KP 16S rRNA 基因序列进化树中，E23 基因序列(NMDC 登录号：NMDCN 0000Q7L)与KP 模式菌株K.pneumoniaeNBRC 14940T(AB680713)稳定地构成一簇，并与Escherichia coli相区分。

图2 基于16S rRNA 基因序列构建的进化树分析环境菌株E23 与其他近源种的亲缘关系Fig.2 Phylogenetic tree reconstructed based on 16S rRNA gene sequences to analyze the relationship between the environmental strain E23 and its related bacterial species

2.2 血清型鉴定

由表5 可知：E23 菌株的医院常见血清型(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)均表现为阴性；阳性对照E4 和R138 菌株K1 血清型扩增结果为阳性，其他血清型为阴性。

表5 不同来源KP 菌株的血清分型Tab.5 Capsular serotype of KP strains

2.3 E23 对玉米的致病性

KP 环境菌株E23 接种玉米2 d 后开始发病，3～4 d 后出现叶片失绿变薄、缺刻和心叶扭曲等玉米细菌性顶腐病的典型症状(图3a)；与接种RC4 和E4(阳性对照)的玉米症状相同(图3b)，其发病率均为100%。分离纯化后的细菌在LB培养基上呈现Klebsiella属细菌的典型菌落形态，回接健康玉米也表现出相同的症状。

图3 接种KP 环境菌株第4 天后玉米发病症状Fig.3 Symptoms of maize on the 4th day after inoculated with environmental strain KP

3 讨论

本研究结合细菌形态学、生理生化特征以及系统发育分析，将从草莓大棚土壤表面分离得到菌株E23 鉴定为肺炎克雷伯氏菌(KP)。研究表明：KP 广泛存在于自然界，土壤也是其常见的非临床栖息地之一，具有极强的生态适应性[16]；但本研究从32 个样本中仅分离到1 株KP，其原因可能是新型冠状病毒肺炎疫情期间校园内定期对露天环境进行消杀所致，而分离出KP 的土样来源于市售腐殖质土，且用于大棚内种植草莓，并未进行消毒。该土壤带菌的原因可能是土壤未能充分腐熟，使KP 残留其中。草莓坐果后，土壤中的KP 能够随着灌溉水的飞溅污染草莓果实，又因草莓为鲜食浆果，没有果皮，若不能将KP 彻底清除，食用后易导致腹痛和腹泻等食物中毒症状，对人体健康具有潜在威胁。目前，各地由于食用被KP 污染的新鲜果蔬所导致的食物中毒事件时有发生[23]。戴宝玲等[24]推测杨梅上检出KP 是由于在采摘、包装和加工过程中徒手操作或包装物污染所致。因此，鲜食果蔬上市前有必要进行KP 检测[23]，并进一步加强食品安全监督，制定市场标准并严格执行。

目前，KP 对人和动物的致病机理及血清分型等研究已取得了一定进展，但有关KP 跨界侵染植物的研究却相对较少。有研究显示：生态适应性是KP 跨界侵染玉米的生态学基础[3]，且同为K1 血清型的临床菌株和环境菌株以及非医院常见血清型的玉米细菌性顶腐病病原KpC4 对小白鼠和玉米均有较高的致病性[3,20]。本研究表明：E23 菌株不具有医院常见的血清型，在人工接种条件下能够导致玉米出现叶片失绿变薄、缺刻和心叶扭曲等玉米细菌性顶腐病的典型症状，表明不同来源的KP 都可以侵染玉米。了解不同来源KP 菌株的系统进化关系及血清分型对玉米细菌性顶腐病的病原学和流行学研究以及玉米细菌性顶腐病的防控具有重要意义，课题组将进一步进行E23 毒力基因的研究并分离鉴定更多的KP 环境菌株，为研究KP 跨界侵染玉米的机制奠定基础。

4 结论

分离自昆明学院南苑大棚草莓土壤表面的E23 菌株鉴定为肺炎克雷伯氏菌。E23 在人工接种条件下能够导致玉米发病，其症状与玉米细菌性顶腐病症状相同。E23 不具有医院常见血清型(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)。