不同植物菌根真菌对石竹科花卉生理特征的影响

胡乃文，王 平，陈科宇，庞 雪，纪宝明

(北京林业大学草业与草原学院，北京 100083)

【研究意义】石竹科植物具有抗逆能力强、观赏性好的特点，被广泛应用于园林景观及草坪边缘点缀，其中以矮雪轮(SilenependulaL.)和常夏石竹(DianthusplumariusL.)最具代表性。两者具有较高的观赏价值、装饰价值及景观用途，是园林绿化中理想的地被植物[1-2]。但在园艺建植过程中，通常采用施肥、喷洒农药等方式来维持景观效果，易造成环境污染。通过利用丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)等生物肥料来代替原有高污染化肥等，不仅有利于节约管理成本，也有利于低碳减排，保护居民健康[3]。【前人研究进展】AMF在陆地生态系统中分布广泛，与大多数陆地植物(包括具有重要经济意义的农业栽培物种)可建立共生体系，通过与植物根系形成共生结构，提升植物的养分吸收能力、抗逆能力和抗病能力[4]。这种共生结构的产生经历了漫长的进化过程，当AMF失去了降解有机物质的酶系，无法营腐生长，不断进化渐渐与宿主植物之间形成了依赖于碳水化合物—矿质养分交换的专性共生体系[5]。在菌根共生体系当中，植物将一部分碳水化合物分配给AMF支持其生长；作为回报，AMF根外菌丝帮助植物吸收土壤中的矿质养分，特别是在土壤中移动性较差植物根系吸收相对困难的养分，如磷(P)、铜(Cu)、锌(Zn)等[6]。在AMF对植物矿质养分吸收影响的研究中发现，接种AMF处理后的两种植物根系对于氮、磷养分的吸收量显著增加，促进了供试植物的生长发育[7-8]。该共生关系对植物地上部光合作用的影响也十分显著，接种AMF对植物叶绿素含量、气孔导度、胞间二氧化碳浓度等均有影响，提高了植物的气体交换效率，对于寄主的光合作用有显著改善，促使光合作用更高效的进行，积累更多的有机物供植株生长发育[9]。丛枝菌根不仅在改善植物矿质营养，调节植物地上部光合作用上产生重要影响，同时在增强植物抗旱性，调节根系发育，凝聚土壤团粒，增强水土保持能力防治土传病害和调节土壤结构等方面也具有重要作用[10-11]。AMF还能够诱导植物形成多种酶、可溶性蛋白和脂类，调节植物体内源激素和酶活性的平衡，并且能改善植株营养状况，提高产量品质[12]。正是由于AMF的广谱适应性和功能多面性，近年来菌根生物技术在农林业和生态工程中的应用得以快速发展。【本研究切入点】目前，AMF在提高植物生物量和增强抗性方面的效果相对显著[13]，但在实际应用过程中，野外条件下AMF对植物光合效率及生物量的提升程度通常低于室内实验结果。其原因可能是由于室内接种实验中通常采用单种或几种AMF作为接种剂进行接种，而在自然状态下的AMF群落中通常包含几十甚至上百个品种，接种剂内AMF品种的相对单一可能导致其功能稳定性较差，限制了野外条件下对植物生长的提升作用[14]。因此，通过探究接种AMF群落对植物生长的促进作用，对于提升AMF菌肥效果的稳定性具有重要意义[15]。【拟解决的关键问题】针对AMF应用于石竹科花卉植物的研究还相对匮乏，作用机制尚不明确。为探究AMF群落对观赏花卉生理特征的提升作用及相关机制，本研究以矮雪轮和常夏石竹为研究对象，通过高通量测序技术和室内实验相结合，探究不同来源的天然AMF群落对石竹科花卉植物生理特征的影响。从而进一步完善对AMF生物菌肥的理解，并为AMF菌肥在生产、应用过程中的推广提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为园林绿化中常见的植物矮雪轮、常夏石竹，种子购于花卉市场。供试AMF取自中国锡林郭勒盟典型草原地区主要优势植物种羊草(Leymuschinensis，LC)、冰草(Agropyroncristatum，AC)、冷蒿(Artemisiafrigida，AF)根围土，采用高通量测序技术测定根围土壤AMF群落组成及多样性后，经由高丹草作为宿主植物扩繁两轮，获得包含孢子、菌丝、根段的土壤混合物为接种剂。播种基质为许昌鄢陵本地[m(土壤)∶m(河沙)=1∶1]，经高温(121 ℃，2 h)灭菌备用，供试花盆容量为1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 AMF的采集 为了尽量减小空间异质性导致的AMF群落差异，选择位于中国内蒙古自治区锡林郭勒盟的中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站(43°38′ N, 116°42′ E; 海拔高度1200～1250 m)的长期围封实验样地进行3种植物根围土采集，该试验样地于1999年10月开始围封，实验样地围封期间没有任何营养元素添加。样品采集于2018年8月中上旬，在围封实验样地内选择植被分布相对均匀的区域，设置4 m×4 m的样方，在样方内采集长势相对一致的3种植物根系周围0～20 cm土层土壤和根系混合样品约2 L作为单株样品，每个样方采集每种植物3株单株样品，并将相同品种植物根围土混合后作为该植物根围土样品，设置5个重复。根据不同样方来源，按植物分不同来源接种剂，将野外采集的根系土壤混合样品内的根系剪碎使其土壤充分混合冷藏备用。

1.2.2 接种处理 在河南省鄢陵县北京林业大学鄢陵协同创新中心温室中进行。试验设3个接种处理，分别单独接种由羊草(Leymuschinensis，LC)、冰草(Agropyroncristatum，AC)、冷蒿(Artemisiafrigida，AF)根围土扩繁后的菌剂，以不接种为对照(CK)，各处理组设6个重复。种子使用75%酒精进行消毒，清洗干净后置于培养皿中，24 ℃，14 h光照无土培养萌发，2～3周后选取长势一致或相近的幼苗用于移植。花盆中加入灭菌基质至其体积的 2/3 处，接种组施加接种剂50 mL，对照组施用筛去真菌的微生物滤液50 mL。将移植后的花卉于组培室中24 ℃、13 h光照培养，每2 d浇灌1次，每盆每次浇水200 mL，期间不进行施肥、施药、修剪等操作。植物生长130 d后收获，分别记录各处理组的成活植株数量，将植株地上、地下部分分别洗净装袋，留作生物量测定使用。取出部分根系，密封袋4 ℃冷藏保存，留作侵染率测定。

1.3 指标测定与方法

1.3.1 AMF序列的扩增和测定 取由围封实验样地采集的3种植物根围土样品，将提取后合格的DNA样品浓度稀释至10 ng/μL，作为DNA模板，使用两轮巢式PCR扩增18S rDNA片段来分析AMF群落的组成[16]。以NS31(5’-TTGGAGGGCAAGTCT GGTGCC-3’)和AML2(5’-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3’)为首轮扩增引物。取1 μL模板，12.5 μL 2×TapMaster Mix，1 μL NS31，1 μL AML2 加无菌水至25 μL体系的PCR小管中混匀。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min[17]。将一轮扩增产物稀释100倍后作为二轮扩增DNA模板，以AMV4-5N(5’-AAG CTC GTA GTT GAA TTT CG-3’)和AMGDR(5’-CCCAACTATCCC TAT TAA TCA T-3’)为二段扩增引物。取2 μL模板，25 μL 2×TapMaster Mix，2 μL AMV4-5N，2 μL AMGDR 加无菌水至50 μL体系的PCR小管中混匀。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；74 ℃ 9 min[18]。用1%琼脂糖凝胶对二段PCR产物进行电泳纯化，并在荧光切胶台下验证PCR产物序列长度，对合格样品进行切胶回收，并使用Nano Drop 2000C分光光度计进行样品的质量和浓度检测，对不合格样品进行补做。最后将全部合格样品按等摩尔混合用于后续测序。用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒(Illumina，美国)进行标准建库，构建的文库经过Qubit和qPCR定量检测合格后，使用Illumina测序平台进行测序。

1.3.4 生物量测定 接种处理5个月后收获植物，将植株放入烘箱在105 ℃下杀青15 min，70 ℃烘干至恒重后，分别称量地上和地下部分干重，计算不同来源AMF对不同供试植株地上及地下生物量的影响。

矮雪轮的侵染率和蒸腾速率与Claroideoglomus菌属相对丰度显著正相关；胞间CO2浓度和Scutellospora菌属相对丰度显著负相关。夏常石竹的侵染率和Claroideoglomus菌属相对丰度显著正相关；其生物量和Archaeospora菌属相对丰度显著正相关(P<0.05，表3)。

矮雪轮的接种实验下，羊草来源接种剂显著提高了其叶片的净光合速率，显著降低了生物量、气孔导度和胞间CO2浓度；冰草来源接种剂显著提高了蒸腾速率和胞间CO2浓度，显著降低了生物量；冷蒿来源接种剂显著提高了生物量，降低了气孔导度和胞间CO2浓度(P>0.05，表2)。羊草来源接种剂对矮雪轮净光合速率的提升能力最强；冰草来源接种剂对矮雪轮的侵染能力和蒸腾速率提升能力最强；冷蒿来源接种剂对矮雪轮生物量的提升能力最强。

1.3.2 光合速率测定 在天气完全晴朗时选择各处理组中长势接近、无病虫害、光照相对均一的健康供试植株叶片，使用光合仪(WALZ-3000)测定光合指标，主要包括净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度，根据测定数据计算并比较不同来源AMF对植物光合作用的影响。

随着人们对生活环境质量的要求越来越高，大气环境的有效监测和治理自然得到了广泛关注，而及时、准确、高效的监测是前提。因此，可以预见激光雷达探测技术今后的发展趋势主要体现在以下三个方面：

1.4 数据分析及图表制作

常夏石竹接种实验下，羊草来源接种剂显著降低了其叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度；冰草来源接种剂显著降低了净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度；冷蒿来源接种剂显著降低了蒸腾速率和气孔导度。整体上，不同来源接种剂对夏常石竹生理特征均有不同程度的抑制作用。

羊草、冰草和冷蒿来源接种剂的AMF群落均以Glomus(羊草：67.40%；冰草：44.65%；冷蒿：69.88%)、Rhizophagus(羊草：12.48%；冰草：18.44%；冷蒿：6.92%)和Diversispora(羊草：9.11%；冰草：13.31%；冷蒿：14.63%)为主要优势菌属。且不同接种剂AMF各属相对丰度差异不显著(P>0.05，图1)。不同来源接种剂AMF群落alpha-多样性(P>0.05，表1)和beta-多样性(P>0.05，图2)差异均不显著，3种不同来源接种剂的AMF群落组成相似。

2 结果与分析

2.1 不同来源AMF接种剂群落特征

桑迪·斯各格兰德（Sandy Skoglund），美国摄影师、装置艺术家，出生于1946年9月11日。她的作品表现出强烈的对比色调，玩弄似乎压倒人体的形式和图案。在她的影像中，手工制作的一系列令人难以置信的精致装置描绘出一个超现实主义的几乎不存在的世界，因为无数的重复和空间的重新创造而引发近乎窒息的观感。

图1 不同接种剂AMF各属相对丰度差异不显著(P>0.05)

图2 不同来源接种剂AMF群落beta-多样性

表1 不同来源接种剂AMF群落alpha-多样性

2.2 不同来源AMF接种剂对石竹科植物生理特征的影响

1.3.3 侵染率测定 使用台盼蓝(曲利苯蓝)染色法测定侵染率[19]。将收获时留取的供试植株根系洗净并用去离子水冲洗，用吸水纸吸干水分，取部分用于测定根系AMF侵染率，首先用10% KOH进行透明，之后用1% HCl酸化，再用0.05%曲利苯蓝染色，然后从每个样品随机抽取30根，置于载玻片上，于100倍光镜下采用交叉法进行观察计算。

表2 不同来源AMF接种剂对石竹科植物生理特征的影响

试验数据采用SPSS(v17.0)软件计算平均值±标准误(SE)。所有测定数据的平均值采用LSD法在显著水平为5%条件下进行比较，分析检验接种不同来源AMF接种剂对植物各指标的影响显著性，采用Excel 2010制图。

2.3 接种剂AMF群落特征与石竹科植物生理特征间相关性

2007年，党的十七大报告明确提出“建设生态文明”是实现全面建设小康社会奋斗目标的新要求：“建设生态文明，基本形成节约能源资源和保护生态环境的产业结构、增长方式、消费模式。循环经济形成较大规模，可再生能源比重显著上升。主要污染物排放得到有效控制，生态环境质量明显改善。生态文明观念在全社会牢固树立。”

表3 AMF群落特征与石竹科植物生理特征间相关性

3 讨 论

AMF能广泛对植物根系进行侵染，从而与植物建立共生关系[20]。侵染程度通常受植物品种、AMF群落特征和环境因素影响[21]。因此，通过测定植物根系侵染率，能够量化AMF与宿主植物根系的亲和力，而二者之间的相互选择决定着菌根的生长发育和其功能效应的发挥程度[22]。本研究中，冰草来源接种剂对石竹科花卉植物的侵染率显著高于其他来源AMF接种剂(P<0.05)。相关性分析显示，Claroideoglomus菌属的相对丰度显著影响AMF群落对石竹科花卉植物的侵染程度(P<0.05)。虽然在统计学角度冰草来源接种剂AMF群落Claroideoglomus菌属的相对丰度与其他来源接种剂没有显著差异，但冰草来源接种剂AMF群落Claroideoglomus菌属的相对丰度相对高于其他来源接种剂。Claroideoglomus菌属对植物生长提供的功能主要为协助植物进行磷吸收[23]。Claroideoglomus菌属在自然生态系统中不同环境条件下均有广泛分布，为Glomerales目下菌种，该类群真菌主要在根皮层细胞内形成丛植结构，是通过无性孢子方式进行繁殖的多核真菌，且孢子体在根内、根外均有形成[24]。但目前并未发现Claroideoglomus菌属对其他类群AMF侵染能力提升的相关报道，因此，Claroideoglomus菌属作为环境适应能力相对较强的AMF类群，其自身在对植物侵染的过程中可能占比较高。

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通过提升植物养分吸收能力提高植物生物量的研究已被大量研究结果证明。但本研究中不同来源的AMF接种剂对石竹科花卉植物生物量的影响并不一致，仅冷蒿来源的AMF接种剂能够对宿主植物生物量产生显著的促进作用，而羊草和冰草来源接种剂对宿主植物的生物量影响不显著，甚至会产生显著的抑制作用(P>0.05)。导致该结果的原因可能是AMF接种剂原有宿主植物的驯化作用对AMF群落功能的影响多为促进多年生优势植物，抑制一年生植物种，本研究中选用的目标植物种均为一年生植物。天然来源的AMF群落是植物群落演替的重要驱动力，羊草和冰草作为内蒙古典型草原优势禾本科多年生植物，为了维持在群落中的优势地位，其驯化的AMF群落对一年生植物的抑制作用可能相对更强，而冷蒿作为草原退化的代表植物种，通常在草地达到中度退化程度时占据优势地位[25]，但在该退化阶段，植物种间竞争压力弱于原生植物群落，植物生存压力主要来源于环境条件的恶劣影响，导致其驯化的AMF功能更加倾向于协助植物生长而非提升自身优势。

通过对植物养分吸收能力的提升以及影响植物自身蛋白质的合成，AMF能够对植物光合过程产生显著影响[26]。本研究中，除羊草来源AMF接种剂显著提升了矮雪轮净光合作用外，其余来源AMF接种剂对矮雪轮净光合速率影响不显著，而羊草、冰草来源AMF接种剂显著抑制了夏常石竹的净光合速率(P>0.05)。与刘兆娜等[27]、韩婷婷等[28]的AMF显著促进花卉植物光合作用的研究结果不一致。由于天然来源AMF群落组成复杂，且其群落功能通常被原宿主植物进行了筛选，因此其作为接种剂对其他植物生长的影响并不一致。

1)关键区4月感热通量的基本特征。关键区4月感热通量的空间分布为高原整体分布中的最大值区域(图2a),其变化具有明显的年际和年代际特征(图5a)。从趋势线看(图5a虚线),2002年前后感热通量发生了转折。从小波分析(图5b)看,关键区感热通量具有4～5 a、7 a的主周期和15 a的副周期,与长江以南地区夏季降水周期4 a、7～8 a很相似。

4 结 论

不同来源AMF接种剂对石竹科花卉植物生理特性的影响存在一定差异，并不是统一的促进作用，且存在部分接种抑制其生长的情况。通过高通量测序技术获得的AMF群落特征并不能对花卉植物生理特征响应的差异进行充分的解释。因此，为了更好的将AMF作为生物肥料投入花卉植物管理过程中的应用，可能要通过更多的AMF群落的定量分析和更精确的物种鉴定，来阐明其作用机制，从而对其进行有效筛选。