农田微塑料对水稻秸秆分解及微生物活性的影响

秦宇辉，李 芬，肖佳敏，林永慧，何兴兵

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

【研究意义】微塑料主要是指粒径小于 5 mm 的塑料颗粒[1]。微塑料广泛分布于生态环境中，目前对于水生生态系统微塑料的污染已经得到广泛且深入的研究，陆生生态系统尤其是与人类生活生产息息相关的农田土壤近年来逐渐引起人们的关注[2]。水稻是南方农田种植的重要农作物之一，水稻秸秆是农田土壤微生物的主要养分来源。研究表明，微塑料能够通过影响微生物活性从而影响水稻秸秆分解，微塑料影响秸秆分解的同时会受到外界因素作用而分解成更小的颗粒，因此研究土壤微塑料对水稻秸秆的分解过程具有重要意义。【前人研究进展】微塑料存在于土壤中，能影响土壤微生物。Machado 等[3]的研究发现微塑料通过影响土壤持水量，团聚体从而影响到土壤微生物，Wan 等[4]研究发现地膜碎屑能增加土壤水分蒸发速率，大颗粒微塑料对水分蒸发速率的影响小于小颗粒微塑料。浓度为 0.1～1.0 mg/kg的PS微塑料使得土壤微生物量显著增加[5]，而1%～20%的PE与PVC微塑料使土壤微生物量有所增加[6]。Machado 等[7]研究了多种微塑料影响土壤微生物活性，PA、PE和PES增加了微生物活性，而其他类型的微塑料对微生物活性影响不显著。Yi 等[8]研究了微塑料形状影响微生物活性，纤维状PP对土壤脲酶的影响大于碎片状PE及颗粒状PP微塑料，而碎片状PE对土壤脱氢酶的影响大于颗粒状及纤维状PP微塑料。土壤中微塑料的分解取决于多种因素，微塑料本身的物理结构、环境温度湿度、土壤微生物等都能对微塑料分解产生一定影响，Sudhakar 等[9]研究发现微生物能通过产生水解酶和氧化还原酶从而加速PE的降解。【本研究切入点】微塑料污染农田土壤环境日益严重，微塑料影响微生物活性以及微塑料自身的分解趋势是不确定的，基于此研究农田微塑料参与秸秆分解所形成的土壤综合分解效应。【拟解决的关键问题】本研究通过分析不同种类、浓度、粒径的微塑料存在的土壤对水稻秸秆分解过程微生物活性的影响以及微塑料残余粒径的分布范围，采用 PCA 分析进一步分析水稻秸秆分解过程中各响应变量与微塑料处理之间的关系，为后续研究农田土壤微塑料的生态效应提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验样地概况

实验样地位于湖南省衡阳市衡南县西南部，该地区属亚热带季风气候，四季分明，多为丘陵地带。水稻田是我国南方最重要的农业土壤之一，水稻收割后大量秸秆在土壤中进行分解。该地区水稻田的生境已经维持了长久的年月，形成了稳定的生态环境。在早春天气寒冷时，水稻育苗需要用到塑料薄膜，或者是种植一些经济作物，需要用塑料薄膜保温或者是减少病虫害等，所以留下了为数不少的塑料薄膜,农村的垃圾(包括塑料)大部分依旧处于乱扔乱焚烧状态，这些塑料也会部分转化为微塑料进入农田，进而可能对土壤性质以及秸秆分解等产生不同程度的影响。

1.2 材料

1.3 实验设计

1.3.1 微塑料 根据已有的有关微塑料研究[10]，选取较为常见的微塑料种类聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)，以不同浓度的微塑料添加量(1%和5%)研究不同种类塑料浓度对秸秆分解的影响。另外选择PE和PP，以小粒径(250～180 μm，S),中粒径(425～250 μm，M)和大粒径(600～425 μm，L)等不同的粒径研究不同种类塑料浓度对秸秆分解的影响(表1)。

表1 秸秆分解实验所涉及的微塑料

1.3.2 水稻秸秆分解实验设计 每组间隔约40 cm，每组5个重复，每个取样点要确保能够放置3个取样的尼龙网袋。将土壤进行采集，去除较大的石头及杂质，按照实验方案的要求将相对应的种类、粒径、添加量的微塑料加入到原生土壤中，混合均匀后，将泥土放入样方中，让尼龙网袋中的秸秆被泥土充分覆盖。实验持续6个月，2019年4—10月[10]，每3个月取1次样，每次取样65袋。

1.4 测定指标与方法

样品取回实验室后置于 4 ℃ 冰箱中暂时保存，以便于测定秸秆干湿重及相应的微生物活性。实验周期结束，取土样，以便于测定微塑料粒径的变化。

微塑料粒径变化的测定：参照Huerta Lwanga的方法[11]，在实验周期结束之后，收集土样，分析两种塑料不同粒径在分解期结束后残余微塑料粒径分布范围。土壤在50 ℃ 烘干，取10 g干土加入烧杯中，添加纯水，轻轻搅拌，使微塑料颗粒漂浮，每个土样进行3～5次漂浮实验。将收集的微塑料用纯水冲洗几次，除去表面附着物，之后进行干燥，通过30目(600 μm)、40目(425 μm)、60目(250 μm)、80目(180 μm)、100目(150 μm)5种不同大小的筛子，确定分解后的微塑料粒径大小范围。

失重率的测定：仔细清理取回样品中的 3 袋秸秆表面的沙粒及根系，以便于进行湿重称量，然后将其置于50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，再称量每袋秸秆样品中凋落物的干重，用于秸秆失重率的计算[12]。

CO2释放量的测定[12]：称取 0.5 g 秸秆置于已灭菌的离心管中，将其置于装有10 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液的无菌锥形瓶中并密封瓶口，放置在25 ℃黑暗条件下培养 48 h，然后用 0.05 mol/L HCl 进行滴定。

秸秆分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可见分光光度计测定酶活性，纤维素酶活性和淀粉酶活性分析均采用二硝基水杨酸法测定[13-15]，木质素酶酶活性分析采用邻联甲苯胺法测定[16]。

1.5 数据分析

采用 Microsoft Excel 2010 软件对实验数据进行统计作表，数据表示为平均值±标准误。为确定不同微塑料处理对于秸秆分解的影响，采用混合效应模型(mixed-model ANOVA，SPSS 16.0)，对固定效应以及样方的随机效应进行分析。如果固定效应或交互作用显著，分别对前、后两时期不同处理之间的变量进行方差分析(采用 Duncan 多重比较法分析两两之间的差异性，显著性水平设定为 α=0.05)。为深入探讨微塑料对后续秸秆分解过程的影响，运用 R 软件(3.2.2)中的 Vegan 包进行影响因素与响应变量关系的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

参考已报道的方法[16]并稍做调整合成复合材料c-MWCNT-MNPs。称取0.2 mg的羧基化多壁碳纳米管粉末于50 mL内含磁搅拌子烧杯中，加入1.8 g乙酸钠和0.7 g FeCl3·H2O，再量取40 mL乙二醇倒入其中，进行磁力搅拌，搅拌30 min，将溶液装入100 mL聚四氟乙烯内胆高温反应釜中，200 ℃下反应12 h。待充分反应结束后，冷却至室温，将内胆中的上清液弃丢，其残留黑色沉淀物用水来回超声清洗5次，之后再用无水乙醇来回超声洗涤5次，用玻璃瓶收集沉淀物，在 60 ℃水浴下利用旋转蒸发仪进行干燥，去溶剂，得到黑色粉末物质即复合材料磁性羧基化多壁碳纳米管，实验备用。

2 结果与分析

2.1 微塑料粒径分析

比较2种微塑料的3种粒径在实验周期结束后残余微塑料的粒径分布范围(表2)，S、M、L表明实验初始微塑料粒径大小范围分别为250～180、425～250、600～425 μm，对于PE(S)、PE(M)、PE(L)3种粒径，分别有66%、74%、80%左右的微塑料分解为更小的微塑料颗粒，粒径较大的相比较粒径较小的分解程度较大。对于PP(S)、PP(M)、PP(L)3种粒径，分别有70%、81%、91%左右的微塑料分解为更小的微塑料颗粒，粒径较大的微塑料粒径同样分解程度较大。对于相同初始粒径范围的PE与PP，实验结束后，PP粒径的分解程度大于PE。

表2 水稻秸秆分解实验结束后残余微塑料的粒径分布范围

2.2 微塑料对水稻秸秆失重率的影响

混合线性模型分析结果表明，在考虑样方随机效应显著的前提下，秸秆的失重率在不同微塑料处理间表现出差异性显著(表3～4，P<0.05)。

表3 水稻秸秆分解过程中微塑料处理固定效应的分析

如图1所示，在分解前期，低浓度PE、高浓度PP和高浓度PVC增加了秸秆失重率，中粒径和大粒径PE、小粒径和大粒径PP增加了秸秆失重率。分解后期，高浓度下PP和PVC增加了秸秆失重率，不同粒径下PP均增加了秸秆失重率，大粒径PP降低了秸秆失重率。分解后期失重率普遍高于分解前期。

表4 水稻秸秆分解过程中微塑料处理随机效应的分析

不同字母表示不同处理在0.05水平上的差异显著性，下同

2.3 微塑料对水稻秸秆分解CO2释放量的影响

混合线性模型分析结果显示，在考虑样方随机效应显著的前提下，秸秆的CO2释放量在不同微塑料处理间仍表现出差异显著，并且在分解时期与微塑料处理间的交互作用也显著(表3～4，P<0.05)。

CO2释放量在一定程度上反映了分解者呼吸代谢的状态。如图2所示，在秸秆分解前期，随着PE浓度增加秸秆的CO2释放量减少，而PP与PVC浓度增加秸秆的CO2释放量增加，PE粒径增加CO2释放量逐渐减少。分解后期，随着PE浓度增加秸秆的CO2释放量增加，而PP与PVC浓度增加时秸秆的CO2释放量逐渐减少。

图2 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期CO2释放量的影响

2.4 微塑料对水稻秸秆分解酶活性的影响

在考虑样方随机效应的前提下，固定效应分析结果显示，5种分解酶在不同微塑料处理间的差异均具有统计学意义(P<0.05)，且交互作用显著(表3～4)，因此需要对不同分解期各酶活在不同微塑料处理之间的差异显著性进行分析。

纤维素是秸秆的主要有机组分之一，其主要降解酶包括外切β-葡聚糖苷酶(Exo-1,4-β-glucanase，C1酶)及羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase，Cx酶)。如图3所示，在秸秆分解前期和后期，微塑料多数提高Cx酶的活性，且随着浓度增加，酶活性增加。图4显示秸秆分解前期和后期，微塑料抑制了C1酶活性，浓度增加，抑制作用越强。另外，分解前期Cx酶和C1酶活性高于分解后期。

图3 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期Cx酶活性的影响

图4 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期C1酶活性的影响

淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)是淀粉水解酶，一般满足于先锋分解者以及机会主义分解者的生长代谢需求。如图5所示，分解后期，微塑料浓度增加，α-淀粉酶活性降低，粒径不断增大，α-淀粉酶活性增加。图6显示分解前期，微塑料对β-淀粉酶起抑制作用；微塑料浓度越高，抑制作用越强。分解后期，微塑料多数对β-淀粉酶起促进作用，粒径不断增大，酶活逐渐减少。分解前期α-淀粉酶与β-淀粉酶普遍高于分解后期。

图5 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期α-淀粉酶活性的影响

图6 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期β-淀粉酶活性的影响

木质素在秸秆分解过程中与失重率密切相关，通常被看作是影响秸秆分解的关键因素之一，而过氧化物酶是木质素主要分解酶之一。如图7所示，分解前期，微塑料对过氧化物酶活性起促进作用，酶活性随PE与PP浓度增加而逐渐减少，但随PVC浓度增加而增加。分解前期过氧化物酶活性普遍低于分解后期。

图7 微塑料对水稻秸秆分解前期和后期过氧化物酶活性的影响

2.5 主成分(PCA)分析

为进一步分析秸秆分解过程中各响应变量与微塑料处理之间的关系，采用PCA法进行分析。如图8所示，在秸秆分解前期和后期间，PC1分析分别解释了 30.94%和32.35%的总方差，PC2分别解释了23.53%和21.47%的总方差。在分解前期，α-淀粉酶、β-淀粉酶和失重率有较好的关联性，PE(M)、PE(L)、PP(S)、PP(M)对失重率起正面作用。在分解后期，β-淀粉酶和Cx酶和失重率有较好的关联性，PE(S)、5%PP、5%PVC对失重率起正面作用。

图8 水稻秸秆分解前期和后期失重率、CO2释放量及微生物酶活性的主成分分析

3 讨 论

(1)通过分析PE和PP的残余微塑料粒径分布范围，发现微塑料都有大幅度分解成小颗粒的趋势。同一种类的微塑料，大粒径微塑料分解程度大于小粒径微塑料，相同初始粒径范围的不同微塑料，PP的分解程度大于PE的分解程度。太阳光的紫外辐射能量能高效地破坏塑料高分子结构，然而在土壤中微塑料分解只能依靠于土壤微生物[17]、土壤动物[18]等，土壤生物影响微塑料的分解是一个漫长的过程，因此本研究中推动微塑料分解最密切的因素可能是由于不同微塑料的结构特性有所不同，大粒径的微塑料相比小粒径微塑料，稳定性较差，同为高分子化合物的PP与PE相比，PP稳定性较差[19]。

(2)在微塑料处理后，多数水稻秸秆的分解率有一定程度增加，不同种类的微塑料对秸秆分解促进效果存在差异，PP与PVC促进效果较为显著，而PE促进效果不显著，失重率多数随着微塑料浓度增加而增大，随着塑料粒径增大而减少。推测是因为微塑料能成为某些微生物的独特栖息地[20-21]，可以有效减缓微生物或微生物分解酶在土壤中受到外部环境的影响，不同的微塑料结构差异导致其对微生物促进效果存在差异[19]。在一定浓度范围内，高浓度的颗粒状微塑料相比较于低浓度颗粒状微塑料，能为微生物提供更多的有利生存环境，对微生物活性产生正面影响[22]，小粒径的微塑料相比大粒径的微塑料，有更大的比表面积，更有利于微生物的生存[23]。

(3)从分解前期到分解后期秸秆累积失重率是增大的，但是失重率增大的幅度变缓了非常多，这可能是由于参与秸秆分解的微生物大多数依赖易获得的淀粉、纤维素等[24]。分解后期木质素含量增加，增加了分解难度，同时微生物分解前期的生物量扩展抑制了木质素分解菌活性，这些潜在因素降低了秸秆后期的分解速率，这与大多数研究的秸秆分解趋势相同[25-26]。微生物产生的分解酶，是秸秆分解的最直接驱动力，微塑料对Cx酶起到促进作用，高浓度微塑料促进效果高于低浓度微塑料。微塑料对C1酶起到抑制作用，微塑料浓度越高，抑制效果越明显。另外，微塑料对α-淀粉酶和β-淀粉酶的影响具有一定的不确定性，而对过氧化物酶起到促进作用。不同微塑料结构存在差异，影响微生物继而导致酶活会有差异[21]，但本研究未能发现酶活因微塑料种类不同有明显规律性差异；纤维素分解酶Cx酶与微塑料浓度成正比，而纤维素分解酶C1酶与微塑料浓度成反比；同等质量的微塑料，粒径越小能提供更多的比表面积[23]，然而本研究中未能体现酶活因粒径大小不同存在显著的变化规律。微塑料基于种类、浓度、粒径对于秸秆分解酶的影响存在不确定性。

本研究中PCA 分析显示秸秆分解前期，α-淀粉酶、β-淀粉酶和失重率有较好的关联性，并且分解前期α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性远大于分解后期这两种酶的活性，说明在分解前期，分解纤维素的微生物与 α-淀粉酶和β-淀粉酶有密切的关联，在分解前期，小粒径PP,中粒径PE和PP及大粒径微塑料均对失重率有促进作用，粒径有关的因素对失重率影响较多，我们推测可能是纤维素分解菌受到不同粒径的微塑料的影响比较明显[27]。秸秆分解后期的过氧化物酶活性远大于分解前期，反映了在分解后期，分解木质素的真菌开始发挥作用，分解后期，PCA分析显示失重率并未和过氧化物酶有较好的相关性，可能是与过氧化物酶相关的木质素分解菌刚开始发挥作用不久，没有对木质素产生大幅度降解。分解后期，5%PP、5%PVC 对失重率有促进作用，较高浓度有关的因素对失重率影响较多，可能是木质素分解菌受到不同浓度的微塑料的影响比较明显[21]。

4 结 论

微塑料对水稻秸秆分解起促进作用，因此微塑料在某种程度上促进了农田生态系统的物质能量循环。本研究中影响微塑料分解的最密切因素来自于微塑料本身的结构特性，对于其他复杂的土壤环境，需要考虑多因素共同作用对微塑料分解的影响。因此，土壤微塑料在农田生态系统中扮演着重要角色，本研究能为进一步研究微塑料的综合土壤效应提供参考依据。