ART-中红外光谱在丁烯酸-β-环糊精酯合成中的应用

李咏富 田竹希 唐洪涛 罗其琪 何扬波 石彬

摘 要：目的：利用衰减全反射（ATR）中红外光谱技术实现丁烯酸-β-环糊精酯制备条件的快速优化。方法：制备丁烯酸-β-环糊精酯以二甲基甲酰胺为溶剂、N，N-羰基二咪唑为羧酸活化剂、二甲氨基吡啶为催化剂;通过分析不同条件下制备的丁烯酸-β-环糊精酯红外图谱中不饱和酯羰基C=O的伸缩振动吸收峰（1 738 cm-1）评价β-环糊精的酯化率。结果：丁烯酸-β-环糊精酯的最佳合成条件为β-环糊精浓度50 mmol/L、二甲氨基吡啶的浓度12.5 mmol/L、丁烯酸浓度450 mmol/L、反应时间20 min、反应温度25℃。结论：ATR红外光谱技术的应用可极大地提升β-环糊精酯样品的分析速度，减少样品分析时间，适合用于丁烯酸-β-环糊精酯合成条件的快速优化。

关键词：中红外光谱;乙烯基β-环糊精衍生物;酯合成;衰减全反射（ATR）

含乙烯基β-环糊精衍生物是制备功能性β-环糊精高分子聚合物的前提[1]。含乙烯基β-环糊精衍生物制备工艺的优化和评价多采用紫外分光光度法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法等手段，但由于这些方法前处理复杂，特别是液相、液质方法，分析时间较长，不利于快速优化制备工艺。红外光谱技术在食品安全领域有着广泛的应用，特别是近红外光谱分析技术，在产地溯源、农药残留、有毒有害物质监测等领域应用更为广泛[2-3]。仇逊超[4]利用近红外分析技术对红松仁脂肪含量进行了定量分析，用偏最小二乘法构建去壳红松仁脂肪定量分析模型，该模型可实现去壳红松仁的快速、无损检测。刘燕德等[5]利用中红外光谱法，甲醇汽油中甲醇的含量决定了汽油的性能。通过中红外光谱对采集的甲醇汽油原始中紅外光谱进行平滑处理、多元散射校正、基线校正、归一化等预处理，建立PLS模型，并利用该模型对甲醇汽油中甲醇含量进行定量检测和分析。于喆源等[6]利用中红外光谱技术对小枣中多糖进行了定量分析，以偏最小二乘法进行多糖含量分析的模型构建。邹胜琼等[7]利用中红外光谱技术建立了一种快速检测白酒基础酒总酯的检测方法。在定量分析过程中，中红外光谱的检测限比其他光谱要高出1～3 个数量级，所以中红外光谱技术在定性及快速定量分析过程中具有重要意义[8]。相较于紫外分光光度法、液相色谱法，在测定新化合物含量方面，中红外光谱技术可以更快地得到分析结果。

中红外技术在新化合物合成中常作为一种辅助手段用于鉴定化合物结构，在新化合物的合成条件筛选中应用较少。衰减全反射（ATR）技术的应用，更加简化了样品制备，中红外检测不再需要溴化钾压片，缩短了样品制备时间[9]。当红外光束与样品接触时，ATR技术通过完全内反射来测量其变化。ATR技术仅需要很少或者完全不需要样品前处理步骤，即可进行定量或者定性的研究，极大地加快了样品分析速度。本研究考察了丁烯酸浓度、二甲氨基吡啶浓度、反应温度、反应时间对丁烯酸β-环糊精酯合成的影响，利用ART中红外技术测定产物的红外特征吸收光谱，并分析不同反应条件下产物的特征吸收光谱峰面积与各单因素水平之间的关系，以达到快速优化制备工艺的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

β-环糊精、丁烯酸、N，N-羰基二咪唑、二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、氢化钙和无水乙醇，均为分析纯试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;实验用水为超纯水;研磨仪（JS39-D 250型），浙江苏泊尔股份有限公司;离心机（湘仪 CTK32），湘仪离心机仪器有限公司;恒温水域磁力搅拌仪（J-HH-6A），冠森生物科技上海公司;ART-红外光谱仪（Spectrum 400），Perkin Elmer Co.美国。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 β-环糊精使用前在100℃烘箱脱水处理24 h;N，N-二甲基甲酰胺使用前加入氢化钙脱水，以保证反应体系无水。样品制备考察了催化剂浓度、丁烯酸浓度、反应时间、反应温度等4个单因素，样品制备中β-环糊精终浓度恒定在50 mmol/L。分别称取环糊精（5 mmol），一定量的丁烯酸和二甲氨基吡啶于三角瓶内，加入50 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解待用。称取一定量的 N，N-羰基二咪唑，加入50 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解。将N，N-羰基二咪唑溶液加入上述三角瓶内于一定反应温度下磁力搅拌，反应一段时间。反应结束后加入30 mL 超纯水停止反应。（1）催化剂浓度：二甲氨基吡啶终浓度选取0、0.25、1.25、2.5、7.5、12.5 mmol/L，丁烯酸终浓度为250 mmol/L、β-环糊精浓度50 mmol/L、N，N-羰基二咪唑终浓度为250 mmol/L，反应温度25℃、反应时间15 min。（2）反应时间：丁烯酸终浓度为250 mmol/L、β-环糊精终浓度为 50 mmol/L、二甲氨基吡啶终浓度1.25 mmol/L、N，N-羰基二咪唑终浓度为250 mmol/L，反应温度25℃，反应时间选取2、5、15、20、30、60 min。（3）反应温度：丁烯酸终浓度为250 mmol/L、β-环糊精终浓度为 50 mmol/L、二甲氨基吡啶终浓度1.25 mmol/L、N，N-羰基二咪唑终浓度为250 mmol/L，反应时间15 min，反应温度选取25、35、45、55、65℃。（4）丁烯酸浓度：丁烯酸终浓度选取50、150、250、350、450 mmol/L，β-环糊精终浓度为 50 mmol/L、二甲氨基吡啶用量1.25 mmol/L，N，N-羰基二咪唑终浓度分别为50、150、250、350 、450 mmol/L，反应温度25℃、反应时间20 min。

1.2.2 样品纯化处理 反应结束后，混合溶液在负压条件下（1 mbar）于55℃减压浓缩，除去溶剂N，N-二甲基甲酰胺;旋转蒸发结束后，在旋蒸瓶内加入50 mL无水乙醇沉淀出粗产物。粗产物和乙醇（50 mL）加入研磨仪粉碎，于转速6 000 r/min条件下离心处理，沉淀重复上述处理2次。离心后的沉淀转移至空SPE小柱（60 mL），加入30 mL乙醇洗涤3次。处理后的沉淀物于55 ℃ 烘干待测。

1.2.3 红外光谱条件 ATR-FTIR谱图采用红外光谱仪Spectrum 400（Perkin Elmer Co.美国）进行检测。ATR附件包含金刚石晶体内反射部件，红外光束的入射角45°。光谱分辨率为4 cm-1，光谱在该分辨率上执行总共16次扫描背景和样本[10-11]。每个样品大约10 mg，加样后立即进行扫描。确保样品表面无空气气泡，在样品上方放置一小块铝箔。采样结束后，ATR附件晶体用75%（v/v）的酒精清洗，在收集下一个样品图谱前，重新进行背景扫描。每个样品重复3次，取其均值使用Origin 2018数据处理软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 化合物红外光谱结构表征

图1A中，在3 310 cm-1下观察到了环糊精中O-H的伸缩振动、在1 409 cm-1出现CH2的变角振动频率、在1 333 cm-1出现了CH的变角振动频率、在1 150～1 000 cm-1下出现了环糊精中C-OH和C-O-C的伸缩振动，在944 cm-1下出现了C-O-C的对称伸缩振动。在丁烯酸-β-环糊精酯中同样观察到了上述特征吸收，说明在形成酯的过程中保留了β-环糊精完整的环状结构。丁烯酸的红外图谱（图1B）中，在1 683 cm-1出现了C=O的伸缩振动，在1 650 cm-1出现了C=C的伸缩振动、在1 421 cm-1出现了COH面内弯曲振动、在1 314 cm-1和1 223 cm-1出现了羧酸C-OH伸缩振动。丁烯酸-β-环糊精酯中，没有出现丁烯酸中的特征频率，在1 738 cm-1出现了不饱和酯羰基C=O伸缩振动[12-13]，这是由于当烯类双键与酯羰基的C原子相连时，共轭效应使羰基振动频率向低频移动;同时丁烯酸-β-环糊精酯保留了不饱和双键C=C的伸缩振动（1 650 cm-1），但该伸缩振动的吸收峰强度显著降低。同时，在1 253 cm-1观察到了酯键中C-O的伸缩振动频率（1 240～1 150 cm-1）[14]，频率升高的原因是由于不饱和双键上的π电子与羰基相的C-O上氧原子的电子形成了大共轭体系，增强了酯键中C-O的键级[15]。对比β-环糊精、丁烯酸和丁烯酸-β-环糊精酯的红外图谱可以证明，丁烯酸-β-环糊精酯的合成。酯羰基伸缩振动吸收峰往往是光谱中最强的谱峰[16]，因此，不饱和酯键中酯羰基C=O的伸缩振动峰可以用来评估β-环糊精的酯化率。

2.2 催化剂浓度的影响

在以N，N-羰基二咪唑为羧酸活化剂的反应体系中，二甲氨基吡啶常作为酰基转移试剂加速反应的发生，特别是有利于加速一些反应位阻较大的酯化反应[17]。添加催化剂后，不饱和酯键中C=O的伸缩振动吸收峰略高于未添加催化剂合成的样品，说明二甲氨基吡啶可以促进酯化反应的发生。当二甲氨基吡啶的使用量在12.5 mmol/L时，C=O的伸缩振动吸收峰最大，因此催化剂用量选择12.5 mmol/L。当催化剂浓度高于该浓度后，丁烯酸-β-环糊精酯的含量有所下降，说明过量的使用催化剂同样会促进副反应的发生（图2）。有学者在白藜芦醇与不饱和脂肪酸的酯化反应中，使用N，N-二甲基甲酰胺做为催化剂，说明其也可作为酰基转移试剂加速酯化反应发生[18]，这也说明了在未添加催化剂的情况下β-环糊精酯化率较高的原因。在N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂的情况下，添加二甲氨基吡啶同样有利于加速β-环糊精的酯化反应。

2.3 反应时间的影响

不饱和酯键中C=O的伸缩振动吸收峰的强度随着反应时间增加，呈现出先增加后降低的趋势（图3），在反应时间为20 min时，C=O伸缩振动吸收峰强度最高。反应时间高于20min后，C=O伸缩振动吸收峰强度降低的原因可能与丁烯酸-β-环糊精酯中不饱和双键的稳定性有关。

2.4 反应温度的影响

如图4所示，随着反应温度的升高，不饱和酯键中C=O伸缩振动的吸收峰的峰面积逐渐变小，特别是在高温条件下（65℃），其峰面积降低了30%以上。提高反应温度，一方面增加了副反应发生，另一方面在较高的反应温度下合成的丁烯酸-β-环糊精酯中的不饱和双键会发生自由基聚合反应，造成不饱和双键含量的降低。因此，反应温度选择25℃为宜。

2.5 丁烯酸用量的影响

丁烯酸浓度对丁烯酸-β-环糊精酯合成的影响最大。随着丁烯酸用量的增加，不饱和酯键中C=O的伸缩振动吸收峰逐渐增高，峰面积逐渐增大（图5）。这是由于β-环糊精含有7个葡萄糖残基，每个葡萄糖残基均含有1个6位羟基（-CH2-OH），理论上每个6位羟基均有可能同丁烯酸形成酯。随着丁烯酸用量增加，不饱和酯键在丁烯酸-β-环糊精酯中的含量也越高。因此，丁烯酸的用量选择450 mmol/L为宜。

3 结论

ATR红外光谱技术的应用，极大地提升了丁烯酸β-环糊精酯样品的分析速度，减少了样品分析时间，适合用于丁烯酸-β-环糊精酯合成条件的快速优化。丁烯酸-β-环糊精酯的最佳合成条件为β-环糊精浓度50 mmol/L、二甲氨基吡啶的浓度为12.5 mmol/L、丁烯酸浓度为450 mmol/L、反应时间为20 min、反应温度为25℃。合成的丁烯酸-β-环糊精酯既保留了环糊精的环状结构，同时也含有不饱和双键，可以作为β-环糊精高分子聚合物的原料。

参考文献

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Application of ART Mid-Infrared Spectroscopy in Synthesis of β-cyclodextrin Butenate

LI Yong-fu1，2，TIAN Zhu-xi1，2，TANG Hong-tao3，LUO Qi-qi1，2，HE Yang-bo1，2，SHI Bin1，2

（1Integrated Rural Development Center，Guizhou Academy of Agricultural Science，Guiyang 550006，China;2Irradiation preservation and processing engineering technology research center of Guizhou agricultural products，Guiyang 550006，China;3National Center for Child Nutriment Quality Supervision and Testing，Beijing 100035，China）

Abstract：Objective To use attenuated total reflection（ATR）mid-infrared spectroscopy to quickly optimize the preparation conditions of β-cyclodextrin butenate.Method β-cyclodextrin butenate was prepared by using dimethylformamide as solvent，N，N-carbonyl diimidazole as carboxylic acid activator and di-methyl-amino-pyridine as catalyst.The esterification rate of β-cyclodextrin was evaluated by analyzing the stretching vibration absorption peak（1 738 cm-1）of unsaturated ester carbonyl C=O in the infrared spectrum of β-cyclodextrin butenate prepared under different conditions.Result The optimum synthesis conditions of butenic acid -β-cyclodextrin were the concentration of β-cyclodextrin 50 mmol/L，the concentration of dimethyl-amino-pyridine 12.5 mmol/L，the concentration of butenic acid 450 mmol/L，the reaction time 20 min，and the reaction temperature 25℃.Conclusion The application of ATR infrared spectroscopy technology can improve the analysis speed of β-cyclodextrin butenate samples greatly and reduce the analysis time of sample，which is suitable for the rapid optimization of the synthesis conditions of β-cyclodextrin butenate.

Keywords：mid-infrared spectrum;Vinyl β-cyclodextrin derivatives;ester synthesis;attenuated total reflection（ATR）