长链非编码RNA Linc01555在结直肠癌中的表达及生物学功能研究

苗志国，罗志鹏，魏海云，吕巧莉，吴芳庚

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率和病死率较高[1]。现阶段，结直肠癌的治疗手段仍以手术治疗及放疗、化疗为主，但治疗后的5年生存率仅有50%[2]。因此，进一步深入研究结直肠癌发生发展机制，对发掘新的干预靶点，开发新型靶向治疗药物，制定有效的结直肠癌防治方案，最终改善患者预后至关重要。结直肠癌的发生发展与基因的异常调控密切相关，但是既往对结直肠癌的研究重点放在传统的编码基因，而近年来随着微阵列技术与核酸测序技术的飞跃发展，越来越多不具有编码蛋白能力的非编码RNA被发现并逐渐引起关注。相关研究[3-4]指出，lncRNA参与转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等功能，另外，其与免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病发展密切相关，特别是恶性肿瘤的发生、发展[5]。相关研究[6]显示，lncRNA ATB高表达与结直肠癌的肿瘤体积、T分期、血管浸润和淋巴结转移正相关。还有研究[7]发现，LncRNA AOC4P在结直肠癌组织中表达减少，与临床病理特征显著相关,是患者预后生存的独立因素。研究[8]发现，lncRNA DANCR在结直肠患者癌组织和肿瘤细胞中高表达，且其过表达与结直肠癌患者的临床分期、肿瘤细胞的增殖和迁移显著相关。现阶段，尚未有关于Linc01555和结直肠癌的相关研究，所以本文旨在通过实验观察Linc01555对结直肠癌患者中的表达特点及并分析其对结直肠癌增殖、迁移、侵袭的影响，试图为结直肠癌的诊断、治疗及预后提供新的理论依据和实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021年1—12月来我院进行手术治疗的100例结直肠癌患者为研究对象，术中收集患者结直肠癌组织及癌旁正常组织(取距肿瘤边缘5 cm，经快速病理检查确定为正常组织，且切缘肿瘤细胞存留为阴性的组织)进行检测。研究对象年龄30～65(45.20±10.50)岁；男58例，女42例；TNM分期：I-II期62例，III-IV期38例；病理分级：I级48例，II级36例，III级16例；淋巴结转移：阳性21例，阴性79例。纳入标准：(1)100例结直肠癌患者均经过病理学检查确诊为结直肠癌；(2)100例结直肠癌患者进行手术治疗前未经过放、化疗等治疗；(3)100例结直肠癌患者的临床资料均完整。排除标准：(1)患者伴有器官功能障碍；(2)肿瘤出现远处转移；(3)患者意识不清不能配合实验进行。本研究得到医院医学伦理委员会批准，且所有患者及其家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析Linc01555水平 通过TCGA数据库分析100例结直肠癌样本及100例结直肠癌旁组织样本的表达数据，通过limma包对数据集进行分析，并提取Linc01555在癌组织和癌旁组织中的表达数据值用于比较分析其表达水平差异。

1.2.2 细胞培养 结直肠癌细胞(SW480)置于含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养基中，在37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中培养24 h。

1.2.3 细胞转染 收集处于对数生长期的结直肠癌细胞，接种于6孔板(5×105/孔)，待细胞融合度达80%时，根据Invitrogen公司Lipofectamine 2000说明书进行siRNA转染处理，将过表达lncRNA Linc01555质粒和空载质粒转入细胞中，分别记为sh-Linc01555组和sh-NC组，培养6 h后更换新鲜培养基，继续培养至48 h后进行后续实验研究。

1.2.4 Linc01555对结直肠癌细胞增殖的影响 收集对数生长期各组结直肠癌细胞，分别接种于96孔板中，密度为3×103个/孔，将过表达lncRNA Linc01555质粒和空载质粒转入细胞中，转染12、24和36 h之后，向每孔加入20 μ的CCK-8试剂，培养时间2 h，于波长为450 nm下使用酶标仪测定吸光度值，然后据此绘制一套吸光度值与浓度之间的生长曲线，观察结直肠癌细胞增殖情况。

1.2.5 Linc01555对结直肠癌细胞凋亡的影响 PBS洗涤细胞样品后加入0.125%不含EDTA的胰蛋白酶消化，消化后悬浮的细胞转至离心管中DMEM终止消化并吹打混匀，低速离心5 min, 弃上清, PBS重悬细胞至浓度为106/mL，按说明书取重悬后细胞离心取沉淀后顺次加入Binding Buffer, FITC荧光标记的Annexin V试剂及Propidium Iodide (PI) 试剂，混匀、避光反应后, 再次加入Binding Buffer并上流式细胞仪检测各组凋亡率。

1.2.6 Linc01555对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响 采用Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭情况。收集转染24 h后的结直肠癌细胞，采用不含有胎牛血清的DEME培养基对细胞进行重悬，将细胞的浓度调整至2×105/100 μL接种于Transwell培养板上室(侵袭实验所用上室经10% Matrigel胶预包被处理)，下室加入550μl含10%胎牛血清的DEME培养基，培养24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定细胞，0.5%结晶紫溶液染色，显微镜下取5个高倍视野进行拍照，计算细胞数量。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织Linc01555相对表达量比较 结直肠癌组织Linc01555相对表达量(20.44±4.56)显著高于癌旁组织(7.65±1.22)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 Linc01555相对表达量比较

2.2 结直肠癌患者Linc01555水平与临床病理资料的相关性 以Linc01555的相对表达量中位数为标准，将结直肠癌患者分为Linc01555低表达组和高表达组。Linc01555的表达水平与临床分期、病理分级、淋巴结转移等临床病理资料之间存在显著的统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 Linc01555表达水平与结直肠癌患者临床病理资料的关系

2.3 2组结直肠癌细胞增殖情况比较 分别于12、24、36 h时比较2组结直肠癌细胞增殖情况，sh-Linc01555组(转染过表达lncRNA Linc01555质粒)增殖活力显著高于sh-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组结直肠癌细胞增殖情况比较

2.4 2组结直肠癌细胞凋亡情况比较 sh-Linc01555组凋亡率显著降低于sh-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2。

图2 sh-NC组、sh-Linc01555组患者结直肠癌细胞凋亡情况比较

表3 2组结直肠癌细胞凋亡情况比较

2.5 2组结直肠癌细胞迁移、侵袭情况比较 sh-Linc01555组迁移及侵袭细胞数显著高于sh-NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组结直肠癌细胞迁移、侵袭的比较

3 讨论

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，发病率和病死率较高，其早期没有显著的临床表现，但随着病情逐渐发展，患者随之出现便秘、腹泻、便中带血等临床表现，发展至晚期还会出现贫血、体重骤降等症状，这严重影响患者的生命安全和生活质量，也给患者及其家庭带来沉重的经济负担。长链非编码RNA与恶性肿瘤的发生发展密切相关。恶性肿瘤的发生发展与促癌基因激活、抑癌基因失活密切相关，近年来，研究[9-10]发现许多lncRNA在肿瘤组织中异常表达，这提示其在肿瘤的发生发展中占据重要地位，它可能是促进肿瘤发生发展的重要因素，也可能是抑制肿瘤增殖分化的重要因素，对于恶性肿瘤的诊断、治疗及预后具有重要意义。相关研究[11]表明，长链非编码RNA对结直肠癌具有显著影响。本文旨在通过实验观察Linc01555对结直肠癌患者中的表达特点及并分析其对结直肠癌增殖、迁移、侵袭的影响，试图为结直肠癌的诊断、治疗及预后提供新的理论依据和实验基础。

lncRNA在多种癌症组织中构建了复杂又精密的调控体系，其表达失调能够引起癌细胞的生物学反应，调控癌细胞增殖、迁移、侵袭等。近些年来，全基因组和转录组测序技术飞速发展，因此与肿瘤发生发展密切相关的长链非编码RNA受到研究人员的广泛关注。长链非编码RNA与DNA、RNA及蛋白质分子等之间存在相互作用的关系，它能够调控染色质构型、转录和转录后调节并在其中扮演重要的角色，它还能影响肿瘤细胞的恶性表型，因此，越来越多的专家将其作为癌症预后的标志物进行研究。相关研究[12]指出，长链非编码RNA MALAT1可以调控AKAP9基因促进结肠癌的发生发展，并且MALAT1高表达可以促进肠上皮细胞的分裂和分化，并且其与结肠癌的转移、分化程度等还具有相关性。还有研究[13]表明，长链非编码RNA HOTAIR促进结直肠癌远处转移，在结直肠癌肝转移时表达尤其显著，其表达同样与结直肠癌的浸润深度、淋巴结及远处转移成正比。研究[14]表明，在人体的多种肿瘤组织中，长链非编码RNA PEG10呈现异常高表达，而沉默长链非编码RNA PEG10基因则能够显著抑制肿瘤细胞的增殖活力及迁移和侵袭能力，这也提示长链非编码RNA PEG10具有癌基因的功能。

前期我们运用生物信息学方法，对癌症基因组图谱计划(the cancer genome atlas TCGA)数据库中结直肠癌和癌旁正常组织信息进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并提取RNA seq的raw count表达值数据进行分析，从中筛选出已知lncRNA表达值，并通过聚类分析及表达差异分析，绘制聚类图，研究表明，Linc01555在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，这表明结直肠癌患者体内Linc01555存在特异性表现，提示Linc01555可能是结直肠癌的诊断、治疗及预后评估相关的新靶点。

为探索结直肠癌患者Linc01555水平与临床病理资料的关系，我们又进行了卡方检验，结果表明，Linc01555的表达水平与临床分期、病理分级、淋巴结转移密切相关，临床分期及病理分级高，淋巴结转移阳性者均伴有Linc01555高表达，这表明Linc01555高表达与结直肠癌的发生发展也存在关系。这一研究结论与长链非编码RNA PEG10在结直肠癌中的表现相类似，徐博文等[15]研究指出长链非编码RNA PEG10与结直肠癌患者肿瘤浸润深度、TNM分期，淋巴结转移情况密切相关。

本研究还通过CCK-8实验观察结直肠癌细胞的增殖情况，实验结果发现，sh-Linc01555组癌细胞的增殖活力显著升高，表明sh-Linc01555能够促进结直肠癌细胞的增殖活力；研究中还通过流式细胞术测定了细胞的凋亡率，结果表明，Linc01555过表达干扰后，结直肠癌细胞的凋亡率降低，并且显著低于sh-NC组，说明Linc01555可抑制结直肠癌细胞凋亡；Transwell实验发现，在sh-Linc01555的作用下，结直肠癌细胞的迁移和侵袭也受到影响，出现明显降低增加，这表明sh-Linc01555可以促进癌细胞的迁移和侵袭，这提示我们或许可以通过负性调控Linc01555水平，即敲低Linc01555来抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭，增加凋亡率。吴建龙等[10]研究指出，结直肠癌患者体内长链非编码RNA LINC00239也呈现高表达，其在实验中敲低LINC00239水平结果发现，结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降，这也从侧面提示调控Linc01555可能会影响结直肠癌的发生与发展。

综上所述，Linc01555在结直肠癌患者癌组织中呈现异常高表达，并且Linc01555表达量与结直肠癌患者的临床分期、病理分级、淋巴结转移等临床病理资料密切相关，另外，Linc01555干扰能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭，促进结直肠癌细胞的凋亡，这表明Linc01555对结直肠癌的靶向治疗及预后具有重要意义，可将Linc01555作为临床治疗结直肠癌的新型靶点。但本研究也存在一定的局限性，一方面，该研究纳入的病例数不算多，且病例的来源相对单一，因此所获得的实验结果具备单一性，还应增加病例数，扩大病例来源进行深入研究；另一方面，Linc01555在结直肠癌发生发展中的具体分子机制尚不明确，也需进行进一步实验探索。