应用总DNA 花粉管导入法改良野生兴安石竹品质培育花卉新品种研究

王东红，郭晓雷，于红梅，魏红梅

（呼和浩特市植物园，内蒙古呼和浩特 010000）

随着园林绿化事业逐渐向生态型、节约型和多样化方向发展，城乡园林绿化要优先使用成本低、适应性强、本地特色鲜明的乡土树种及花草。内蒙古中西部地区干旱、半干旱野生植物资源丰富，是天然的抗性基因库。合理开发利用野生植物资源，不仅能打造出具有地方特色的景观，而且对城市生态环境建设和生物多样性保护具有重要意义[1]。

呼和浩特市园林科研所自2005 年成立“野生植物研究课题组”以来，系统调查和研究了内蒙古中西部地区野生植物的分布范围、生境状况、生长海拔、土壤性质等，对具有较高观赏效果和较强抗逆性的野生植物成功进行引种驯化。截至目前，完成引种驯化栽培和迁地移栽品种共计40 个科104 个属174 种，驯化成功130 余种，其中，筛选出50 种具有较高园林应用价值的品种，推广应用播种、扦插、分株、组培等技术，并总结了野生植物在园林应用中的优缺点。

野生植物具有抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病虫害等抗性强的优点及节水、节省劳动力等优势，既能降低绿化成本，又能减少外来苗木对本地生态平衡的影响。但野生植物观赏性较差，制约了其在园林绿化中的推广应用。因此，改良和培育具有本地特色，适应本地自然条件，拥有自主知识产权的乡土野生观赏植物新品种，成为新的研究方向。

1 试验材料

1.1 受体植物——兴安石竹（）(见图1）

图1 兴安石竹

受体植物是呼和浩特市园林科研所“野生植物研究课题组”2006 年9 月从大青山呼和浩特段采集并引种驯化的野生植物。兴安石竹花朵数量多、种子数量大、柱头便于操作，可作为花粉管导入总DNA 试验的材料。

1.1.1 生物学特性。兴安属石竹科石竹属草本植物，株高20～40cm，成苗冠径40cm 左右。茎基部簇生，叶披针状条形或条形，花边缘有不整齐齿裂，花色呈红紫色、粉红色、白色，雌蕊2 个，雄蕊较多，花期6-9 月，果期8-10 月，野生种子发芽率达75%，千粒重0.42g，播种当年可开花。

1.1.2 优缺点及改良目标。兴安石竹优点是抗逆性强、节水、耐旱，株型丰满，着花数量和单花种子数量多，植株高度整齐，当年开花，花色鲜艳。缺点是植株会出现自然退化现象。改良目标是延迟或改变退化现象，丰富花色、花形。

1.2 供体植物——剪秋萝（红色）（（见图2）

图2 剪秋萝

供体植物选自呼市植物园内，与受体植物是同科不同属植物。

1.2.1 生物学特性。剪秋罗别名大花剪秋罗，属石竹科剪秋罗属植物，为多年生草本植物。高50～80cm，茎直立，叶片呈卵状长圆形或卵状披针形，二歧聚伞花序，花瓣深红色，蒴果为长椭圆状卵形，花期6-7 月、果期8-9 月。

1.2.2 优缺点及改良目标。剪秋罗优点是花色显眼，株型直立、健壮，缺点是株型冠径小、分枝和着花数量少、花朵小，改良目标是株型丰满、分枝多、花朵大、着花数量多。

2 试验方法

2.1 花粉管通道法[2-3]

花粉管通道法转化技术以DNA 片段杂交假说为理论基础，1979 年由我国学者周光宇提出。主要原理是利用植物受粉后形成的天然花粉管通道（花粉引导组织），将外源DNA 片段整合进受体基因组中，达到遗传转化的目的，这一技术原理可应用于任何开花植物。花粉管通道法导入的方法有：柱头滴加法、花粉粒携带法、子房注射法等[1-2]，本研究采用柱头滴加法。

2.1.1 影响DNA 花粉管导入和转化的因素[4]。（1）供体DNA 质量要求：花粉管导入法对导入的供体DNA 片段的大小及纯度都有较高要求，在DNA 的纯化过程中，既要保持DNA 片段的完整性，又要去除蛋白质或RNA 等杂质的干扰。（2）供体DNA 的浓度和注入量：不同的植物花器各不相同，适宜的DNA 浓度和量也不同。根据植物的花器特点和试验摸索，以受体花器不受损害为前提，确定最佳浓度范围和用量，一定范围内随供体DNA浓度的增加，注入量增大，则转化率越高。（3）供体DNA导入时期：根据花粉管通道法导入原理，最适宜的导入时期应限定在精卵融合至合子分裂前这一段时间，即以花粉管延伸到胚囊后开始导入为宜。（4）其他因素：理论上可不考虑供体和受体的亲缘关系，但一般供体与受体同源性高，其DNA 片段较易整合到受体染色体上，选择最适合的导入方法也是影响转化的因素。此外，操作技术及环境因素也会对DNA 的导入和转化产生影响。

2.1.2 花粉管通道法的优点[5-6]。操作简单，在温室、大田或盆栽中都可进行；利用整体植株的受精卵、卵细胞或早期胚细胞进行转化，可直接根据目标性状的表现进行筛选；缩短育种时间；不受基因型影响；适合所有开花植物。

2.1.3 花粉管通道法的缺点[5-6]。操作过程中易受环境条件影响；整合不稳定，会引起性状的大量分离，需经过多代的自交纯化，才能得到目标性状纯合稳定的后代；转化率较低，约为1%，转基因表达效率低，转化过程中产生非期望变异多，变异具有随机性、广泛性；操作经验性强，需不断探索技巧；只局限于开花时期。

2.2 试验步骤

首先，观察受体植物花型信息，观察单花状态及花开不同时期，雌蕊柱头的变化，确定最佳授粉时间。其次，通过采集受体植物花粉进行离体培养，测定花粉管生长速度，同时，参考相关文献资料，确定总DNA 导入时间、浓度及导入量。

2.2.1 受体植物——兴安石竹单花状态及柱头的观察。由表1 和图3 可知，从花开状态2（即花瓣包合，伸出萼片0.5cm）开始就可授粉，这时柱头发亮、凸起、黏液逐渐增多。单花从包合状态到完全开放需10d，到花瓣枯萎需15d，到种子成熟需28d。

表1 兴安石竹单花状态及柱头、花药的观察结果

图3 兴安石竹4 种开花状态及柱头、花药

2.2.2 供体植物总DNA 的提取。取剪秋萝嫩叶若干克，采用TIANGEN 植物基因组DNA 提取试剂盒和CTAB法，提取供体植物总DNA。

2.2.3 DNA 纯度和浓度的测定。用DNA 浓度测量仪测定，OD260∶OD280 比值应为1.7∶1.9，比值过高则纯度不高。浓度调整可用真空浓缩仪和ddH2O 稀释以达到所需浓度。

2.2.4 提取供体植物总DNA 的浓度和体积（见表2）。

表2 提取供体植物总DNA 的浓度和体积

图4 导入DNA 套袋

图5 导入DNA 结种

3 结果与分析

将不同浓度剪秋萝的总DNA 导入到兴安石竹的试验中，采收到种子数量结果（见表3）。

表3 不同浓度的总DNA 导入后采收的种子数量

2013 年收到266 粒种子，其中部分不饱满，播种后有少量发芽，观察植株生长及开花情况，发现有3 株在花朵上有明显变化（见图6）。

图6 子一代变异与原花对比

变异1：花朵中央的环形花纹消失，叶形、株形无变化。变异2：花朵中央的环形花纹消失，花瓣出现辐射状白色条纹，且花瓣形状有变化，基部变窄，使花瓣间分离，叶形、株形无变化。变异3：花瓣形状有变化，基部变窄，使花瓣间分离，叶形、株形无变化。第2 年，观察采收的变异植株种子播种情况，发现变异全部消失，且母株变异也基本消失（见图7）。

图7 变异兴安石竹第2 年

由上述试验可知，用花粉管导入法导入外源总DNA 较易获得变异植株，但不一定是目标变异，变异具有随机性，要想获得目标变异，需做大量的工作和一定的机遇，同时，DNA 整合具有不稳定性。2014 年调整浓度，以100ng/μL、300 ng/μL、500ng/μL 浓度梯度5μL滴加于花柱断面上，结果只有300ng/μL 浓度梯度的结种子，考虑因为500ng/μL 浓度梯度过高而损伤花器，100ng/μL 浓度梯度人为操作不当，导致不结种子，采收的种子需进行播种并观察是否有变异。现有结果可以说明，花粉管导入法导入外源总DNA 可获得转化的种子和植株，若要获得目标变异性状，需要时间和机遇。

4 结语

（1）了解和掌握受体植物的生殖、生理及物候期特性，在不考虑转化率的前提下，采取柱头切割方式，导入总DNA 的方法、浓度和时间及实践操作技术都会直接影响结种。因此，优化技术参数是导入成功与否和提高导入效率的前提条件，也是外源DNA 片断能否整合到受体基因组的因素之一。目前，还没有关于野生植物为受体技术参数方面的报道，同科属种的栽培种只可作为参考和借鉴，导入的手段和技术参数还需在实践中摸索总结和优化。

（2）在实际操作技术方面，柱头滴加溶液时，因导入液体的表面张力使DNA 溶液不容易渗入，兴安石竹的柱头小，采用反复滴加后套袋。柱头切割要在不损伤花器的前提下尽可能短截，以减少外源DNA 导入的路径，试验中得出结论是在柱头1cm 以下切割1/2 较合适。此外，采用柱头斜切、负压处理、浸渍吸收等措施，都会有助于外源DNA 溶液的渗入，从而提高导入率。

（3）滴加外源DNA 总量和浓度与受体花的大小有一定关系，滴加外源DNA 总量和浓度采用高浓度时，要减少滴加量，浓度过高会损伤花器，而进行反复滴加时则用低浓度。

（4）不同植物种类导入DNA 时机大不相同，基本无规律可循，同时，花粉萌发、花粉管进入胚囊及受精过程会因自然条件，如气候、温度、湿度等的变化而有差异。只有当花粉管生长到花柱底部，到形成具有正常细胞壁的合子之前的这一段时间导入才有可能被整合，因此，在实际操作中要综合考虑，适时调整。

通过花粉管导入总DNA 的方法较多，如花粉管通道法、子房注射法、外源DNA 直接涂抹法、花粉匀浆涂抹柱头法、外源DNA 溶液浸泡花粉授粉法等，不同的方法各有特点，应根据受体植物的花器特点考虑最佳导入方法。

本研究以野生植物作为受体，也可以用野生植物作为供体，导入栽培种植物中，可增强栽培种抗逆性，从而获得优良新品种。