高效液相色谱-质谱联用法同时测定盐酸二甲双胍肠溶片中6种亚硝胺类基因毒性杂质

徐艳梅，李挥，张素平，乔晓宁，苗会娟，盖成，王茉莉，高燕霞

（河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050200）

基因毒性杂质的毒性是近年来人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）、美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）等国外药监部门密切关注的问题。基因毒性杂质可以直接或间接地损害DNA，从而导致基因突变或癌症，对人体具有潜在的危害［1］。自从缬沙坦检出N-亚硝胺类基因毒性杂质后，国内外持续对N-亚硝胺类基因毒性杂质高度关注。虽然基因毒性杂质的检测已经开展了很多年，但却集中在食品［2-7］、水［8-12］、烟草［13-14］等领域。随着对药品中基因毒性杂质的控制越来越严格，检测药品中N-亚硝胺类基因毒性杂质的研究方法逐渐增多［15-18］。

盐酸二甲双胍是目前国内外应用较为广泛的降糖药，其价格便宜、疗效好、不良反应少，是治疗单纯经饮食和运动不能良好控制的2型糖尿病的一线降糖药物。然而，2020年6月份，FDA发文表示，在一些二甲双胍制剂中，N-亚硝胺类基因毒性杂质含量超出限度，并建议一部分企业自愿召回［19］。目前，国内有高效液相色谱-质谱法用于测定盐酸二甲双胍片及二甲双胍格列本脲胶囊［20］中N-亚硝基二甲胺（NDMA）的报道，刘博等［21］使用液相色谱-质谱联用技术测定了盐酸二甲双胍缓释片中7种亚硝胺类基因毒性杂质。气相色谱-质谱法也被文松松等［22］用于盐酸二甲双胍缓释片及二甲双胍格列苯脲片等多种剂型中NDMA的测定。然而目前我国并没有对于盐酸二甲双胍肠溶片中N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定。鉴于液相-色谱质谱联用技术灵敏性较高可完成微量基因毒性杂质的测定，为确保药品应用的安全，笔者参考以往实验方法［21-24］，建立了高效液相色谱-质谱联用法同时测定盐酸二甲双胍肠溶片中6种基因毒性杂质的方法，并进行了方法学验证。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用系统：高效液相色谱仪配备LC-30AD二元泵、CTO-20AC柱温箱、SIL-30AC自动进样器、SPD-20A紫外检测器，日本岛津公司；Triple Quad 6500型质谱仪，美国AB SCIEX公司。

电子天平：XS105型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒托利多有限公司。

盐酸二甲双胍肠溶片：批号分别为72105111、72105112、72105113，市购。

甲醇、甲酸：色谱纯，赛默飞世尔科技中国有限公司。

实验用水为超纯水。

6种基因毒性杂质对照品信息列于表1。

表1 6种基因毒性杂质对照品信息

1.2 溶液的制备

供试品溶液：取盐酸二甲双胍肠溶片20片，研细，精密称取500 mg，置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶液振摇使其溶解，用水定容至标线，摇匀，即得。

对照品储备溶液：分别称取对照品各25 mg，精密称定，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液适量使其溶解，并稀释至标线，摇匀，制成各化合物质量浓度均为1 mg/mL的对照品储备溶液。

NDEA、NDMA、NMBA、NDBA、NDIPA、NEIPA混合对照品溶液：分别精密量取6种物质的对照品储备液适量置于同一容量瓶中，用甲醇溶液稀释至标线，摇匀，制成各物质质量浓度均为0.1 μg/mL的混合对照品溶液。分析前用甲醇稀释成系列浓度。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱

色 谱 柱：ACE C18-HL柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司）；柱温：40 ℃；流动相：A相为0.1%甲酸水，B相为甲醇；洗脱模式：梯度洗脱，洗脱程序列于表2；流量：0.6 mL/min；进样体积：5 μL。

表2 洗脱程序

1.3.2 质谱条件

离子源为大气压化学电离源（APCI源）；正离子模式检测；扫描模式为多反应监测模式（MRM）；离子源温度：350 ℃；脱溶剂气流量：35 mL/min；NC电 流：3 μA；气帘气（CUR）：206.8 kPa；雾化气（GS1）：241.3 kPa。其它实验参数列于表3。

表3 质谱条件

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

通过改变流量、柱温、流动相B的初始比例对1.3中方法的耐用性进行了考察［23-24］。结果表明，对流量、柱温、流动相B的初始比例进行微调后，各物质色谱峰峰面积基本一致，即6种N-亚硝胺类基因毒性杂质的测定量基本一致，说明该方法中的色谱条件耐用性良好。

2.2 溶剂的选择

分别选取水、甲醇及50%甲醇作为溶剂进行了考察。盐酸二甲双胍肠溶片中含有辅料羟丙甲纤维素，其溶于水及大多数极性溶剂，然而羟丙甲纤维素在水中会溶胀成澄清或微浊胶体溶液，严重影响盐酸二甲双胍的溶解性，故应避免使用水及水溶液作为溶剂，因此选择甲醇作为溶剂。

2.3 专属性考察

取混合对照品溶液、供试品溶液和溶剂，分别按1.3项下色谱条件进样分析，记录色谱图，溶剂、供试品溶液和混合对照品溶液色谱图分别见图1、图2、图3。

图1 溶剂色谱图

图2 供试品溶液色谱图

图3 混合对照品溶液色谱图

测定结果表明，溶剂不干扰测定，NDEA、NDMA、NMBA、NDBA、NDIPA、NEIPA在该色谱条件下分离度良好。

2.4 线性关系、检定限与定量限

分别精密量取1.2中混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至标线，制成各物质质量浓度分别为1、2、5、10、50、100 ng/mL的系列混合标准工作溶液。按1.3色谱条件进样分析，记录色谱图，以NDEA、NDMA、NMBA、NDBA、NDIPA、NEIPA的质量浓度为横坐标（x），以色谱峰峰面积为纵坐标（x），绘制标准曲线，计算得到线性回归方程与相关系数，结果列于表4。

取混合对照品溶液逐步稀释成不同浓度，按1.3色谱条件进样分析，连续测定6次，记录色谱图，以信噪比S/N=3和S/N=10分别作为检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表4。

由表4可知，6种化合物在各自范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.999 5，方法灵敏度高。检测限和定量限分别为0.033 7～0.0338 9 ng/mL和0.100 76～0.102 68 ng/mL。

表4 6种化合物的线性方程、相关系数、线性范围、LOD、LOQ

2.5 仪器精密度与重复性试验

精密量取1.2中混合对照品溶液，按1.3项下色谱条件进样分析，重复进样6次，记录色谱图，计算各化合物色谱峰峰面积的相对标准偏差，考察本方法的仪器精密度，结果列于表5。

表5 仪器精密度实验结果

由表5可知，6种N-亚硝胺类化合物测定结果的相对标准偏差为0.8～3.5%，表明仪器的精密度良好。

2.6 加样回收试验

精密称取空白供试品约100 mg，共9份，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解，再分别精密加入混合对照品溶液0.2、0.5、1.0 mL各3份，加甲醇定容至标线，摇匀。按1.3的色谱条件进样分析，记录色谱图，计算加标回收率，结果列于表6。由表6可知，6种N-亚硝胺类平均回收率为97.83%～103.33%，测定结果的相对标准偏差为1.19%～4.45%，表明本法的回收率良好。

表6 加样回收率试验结果

2.7 稳定性试验

按1.2方法制备混合对照品溶液和供试品溶液，于室温放置0、1、2、3、6、10 h后按1.3项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算各物质含量的相对标准偏差，考察其稳定性，结果见表7。

由表7可知，6种N-亚硝胺类对照品含量测定结果的相对标准偏差为0.3%～1.8%，表明对照品溶液与供试品溶液在10 h内稳定性良好。

表7 不同时间下6种N-亚硝胺类物质色谱峰面积

3 结语

建立了高效液相色谱-质谱联用法适用于盐酸二甲双胍肠溶片中6种亚硝胺类基因毒性杂质的同时检测，且检测结果准确，操作简便、灵敏，可用于监控盐酸二甲双胍肠溶片中基因毒性杂质的水平，为其质量控制提供参考，同时能够更好的确保药品的安全性，具有实际的应用价值。