多酶共固定化技术在糖类催化中的研究进展

唐婷，周文凤，王志，朱晨杰，许敬亮，庄伟，应汉杰，欧阳平凯

（1 郑州大学化工学院，生物 +联合研究中心，河南 郑州 450002；2 南京工业大学生物与制药工程学院，国家 生化工程技术研究中心，江苏 南京 211816）

糖类是一种天然、多功能、可再生的有机分子，其催化转化一方面可以减少自然界生物质资源的浪费，另一方面可以将糖类转化为附加值高的多种产品，如药物、食品添加剂、生物质燃料等，广泛应用于人们日常生活和工业生产中。在糖类的催化反应中，传统的化学催化法存在催化效率低、设备腐蚀严重、分离困难、污染环境等问题，阻碍了糖类的高效转化和实际应用。相比之下，固定化酶催化技术不仅反应条件温和、选择性好、专一性高、催化效率高，而且稳定性强，便于回收和重复利用，为糖类的催化反应提供了一条绿色高效的途径，引起了研究者的极大兴趣。

糖类结构繁多，催化过程复杂，往往需要多种酶共同参与完成，单酶固定化技术显然难以满足需求，因此，发展基于级联反应的多酶共固定化技术是糖类催化的必然选择。多酶共固定化技术是在单酶固定化的基础上发展起来的，简单来说，就是通过物理、化学或生物亲和等方法，将多种酶或含酶细胞固定于同一个载体上，使多种酶之间协同作用，充分发挥其催化特性。在共固定化多酶的级联催化过程中，一种酶的产物往往是另一种酶的底物，通过缩短底物的传输距离和反应时间，减少了中间物的积累和抑制，能够获得更高的催化效率和更少的污染物。此外，多酶共固定化技术简化了多步反应的复杂流程，更易获得目标产物。

目前，多酶共固定化技术已广泛应用于食品、医药、能源、环境保护等行业，尤其在糖类催化领域的发展最为广泛和深入，并形成了很多新成果。鉴于此，本文论述了糖类催化中常用的多酶共固定化方法（包括传统方法和新型方法），介绍了多酶共固定化技术在糖类催化中的应用，分析了存在的问题并对其发展前景进行展望，以期为该领域的进一步发展提供有益参考。

1 糖类催化中常用的多酶共固定化方法

根据酶与载体之间结合方式的不同，多酶共固定化方法可分为多种类型，主要包括发展较为成熟的4种传统固定化方法以及近年来出现的一些新型固定化技术。本节对糖类催化中常用的共固定化方法进行论述，并对其优缺点加以讨论。

1.1 传统固定化技术

传统固定化技术是发展成熟且目前最为常用的方法。通常包括4种，即吸附法、包埋法、共价法和交联法，其基本原理及优缺点如表1所示。传统法的应用范围比较广，适合大部分的多酶催化体系。但在对某一特定的多酶体系进行共固定化时，要充分考虑载体的特点、多酶的性质、级联反应的类型以及酶与载体之间的相互作用等多种因素，并在此基础上选择合适的方法以实现最佳催化效果。此外，在实际应用中，还可以将多种方法联用以提高固定化酶的性能，如吸附-交联法、吸附-共价法不仅能增加酶蛋白负载量，还可以使共固定化多酶的稳定性大幅度提高。

表1 目前常用的几种传统固定化技术及其比较

总体而言，以上4 种传统固定化方法各具优势，与游离酶相比，制备的固定化多酶均展现出良好的稳定性和重复利用性。然而，这些方法都具有一定的局限性，容易出现酶分子的随机排列和相互堆积的现象，无法实现酶分子在载体上的精确有序定位，使整体酶活及催化效率受到限制。

1.2 新型固定化技术

为了克服传统固定化技术的不足，近年来国内外研究者开始探究一些新型固定化方法。通过精确控制不同酶之间的空间取向或相对位置，使酶蛋白活性位点充分暴露或缩短底物分子的传输距离，以提高多酶体系的催化效率。其中，应用较为广泛的是生物固定化法，按照技术原理的不同又可分为金属亲和标签固定化技术、生物亲和固定化技术以及DNA定向固定化技术。

1.2.1 金属亲和标签固定化技术

金属亲和标签固定化技术是利用某些氨基酸与过渡金属离子（Fe、Co、Ni等）形成配位键而使酶分子固定在载体上的一种方法。适当的亲和标签可以用于修饰酶分子，并提高固定化酶的催化效率。常用的金属亲和标签为六组氨酸（6×His），它可以温和地结合在酶分子的C端或N端，然后与载体上的Ni特异性结合，从而实现酶在载体上的定向固定。

Liu 等利用这一原理将七种酶通过六组氨酸标签固定在镍琼脂糖珠上，并装填于反应柱中，构建了七酶级联催化反应体系，用于尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）的合成。由于多酶之间的临近效应和协同催化作用，该固定化酶体系表现出较好的催化活性，反应混合物连续催化48h可将50%的尿苷单磷酸（UMP）转化为UDP-半乳糖，反应24h的产物产量（1.80g/L）远大于溶液中的游离酶（1.26g/L）。此外，该法制备的固定化酶稳定性良好，是一种利用廉价原材料生产UDP-半乳糖的有效方案。利用相似的工作原理，Plž课题组将His标签标记的酮基还原酶（KRED）和葡萄糖脱氢酶（GDH）共固定在含Ni的琼脂糖基质上，制备了重复间歇流生物反应器。基于双酶正交级联反应的原理，GDH 催化所产生的NADP正好满足了主反应对辅因子的需求，充分发挥了多酶协同催化的优势。这种精心设计的固定化多酶系统具有比游离酶更好的底物耐受性，反应转化率可达95%。

金属亲和标签固定化是一种较为温和的固定化方法。亲和标签相对较小的尺寸和低电荷量减少了对酶蛋白活性的干扰，并可以实现与功能化载体的特异性结合。目前，很多酶的亲和标签都可以通过基因编码来完成。但是该法仍存在一些缺点，如载体和酶的修饰过程烦琐，有时会出现金属离子易脱落、选择性低、亲和力不高等缺点，且一般适用于活性中心远离C端或N端的酶分子。

1.2.2 生物亲和固定化技术

生物亲和固定化技术，是利用某些生物分子间的特异性结合将酶分子固定到载体上的一种新型方法。根据亲和分子种类的差异，该技术包括抗原-抗体亲和法、亲和素-生物素亲和法和凝集素-糖类亲和法等。

Jia 等基于抗原-抗体亲和作用定向固定化酶的原理，制备了电化学免疫传感器，用于检测肿瘤标志物。该制作过程主要分为三个部分，如图1所示：第一部分（a），将硫堇（THI）标记的CEA-抗体及二茂铁（Fc）标记的AFP-抗体分别结合在铂纳米粒子功能化的氧化石墨烯上，并以此作为共固定化HRP 和GOD 的复合载体；第二部分（b），将金纳米粒子（AuNPS）沉积到玻碳电极（GCE）表面，用于结合大量的CEA-抗体和AFP-抗体；第三部分（c），通过加入CEA 和AFP 两种抗原使两类复合载体结合，从而将GOD 和HRP 定向固定在复合电极上。在此反应体系中，葡萄糖经GOD和HRP 的级联催化产生电化学信号，并经由“夹心载体”将免疫信号放大，从而实现了对抗原的快速灵敏检测。这种免疫检测器具有良好的选择性、稳定性和重现性，且检测限较低（CEA 为1.64×10g/L，AFP 为1.33×10g/L），可用于临床血清的检测与分析。

图1 CEA、AFP免疫信号放大生物传感器示意图[29]

Mansur小组将蔗糖酶（INV）、GOx、HRP分别与生物素结合形成酶-生物素复合物，然后利用生物素-亲和素的相互作用，将三种酶层层组装，建立了具有3D构架的固定化多酶级联系统（图2）。与游离酶相比，这种生物亲和固定化酶表现出良好的催化活性和更高的底物亲和性，其值仅为游离酶的1/3，这一方面是因为双酶经固定化后借助载体表面的亲水性增加了对底物的亲和性，另一方面由于多酶之间的有序排列和构建的反应微环境促进了底物向酶活性位点的靠近。此外，他们还重点研究了三酶的相对位置对整体活性的影响，结果表明当酶的排列顺序不同时，反应体系的催化效率也随之变化，这种差异可归因于多种因素，如不同排列方式对酶构象的影响、空间位阻以及级联反应的途径等。

图2 生物素-亲和素法固定化INV、GOx和HRP[30]

Chen等以功能化多壁碳纳米管（MCNTs）作为载体，利用糖-凝集素之间的亲和作用，通过层层组装的方式构建了HRP-GOD 双酶传感器（图3）。该固定化策略既完成了对单个酶的调控，也实现了双酶的定向有序组装。这种MCNT-酶纳米复合材料对葡萄糖的线性响应范围为2.0×10～1.7×10mol/L，检测限可低至2.5×10mol/L，且具有快速的响应性（响应时间小于5s）、高度的选择性和良好的稳定性，可直接用于测定血清中的葡萄糖。

图3 基于功能化MCNTs和糖-凝集素特异性作用的双酶仿生纳米电极[31]

与金属亲和标签固定化技术相比，生物亲和固定化的亲和作用力更强且具有高度的专一性，因此制备的固定化酶不仅能够较大程度地保留原始酶活，而且具有较好的稳定性。但是由于使用的生物亲和标签价格昂贵，且酶分子改性过程较为烦琐，因此一般不适用于工业生产的多酶催化体系。

1.2.3 DNA定向固定化技术

DNA定向固定化（DDI）技术是一种具有高度特异性和位点可选择性的固定化方法，能够精确地控制酶的空间位置及方向，调节多酶之间的相对距离以提高整体催化效率。此外，DNA片段自身具有良好的机械刚性和生物相容性，不仅能够充分保护酶的活性，还能提高固定化酶的稳定性。

最简单的DNA 定向固定化酶是通过两条互补的DNA 短链来实现的。简言之，将探针DNA 链（P）与载体结合，目标DNA单链（C）与酶分子结合，然后利用两种链（P 和C）之间的碱基互补作用实现酶分子在载体上定向固定。Yang课题组通过这种方法，将HRP 和GOx 共固定在多巴胺衍生物改性的磁性纳米颗粒上（图4）。制备的DNA 定向共固定化酶具有较好的底物亲和性和优异的酶学性能，其值为游离酶的0.73 倍，相对酶活比游离酶高20%，比单酶定向固定化高55%，且能够利用其磁分离特性进行多次回收利用，在重复催化13 个批次后仍可保持75%的活性。此外，该方案还可以通过调节载体上两种官能团的数量来调节固定化双酶的比例，以获得最佳催化效率。这种DNA 定向固定化技术为制备人工多酶复合物提供了一条新途径，可应用于医疗诊断、生物医学设备和生物技术中。

图4 多功能磁性纳米粒子上的DNA定向固定化多酶[33]

DNA 自组装技术是另一种较为复杂的DNA 定向固定化方法。它是对多条DNA 链进行独特的空间设计，使之形成多维组装体，用于定向固定不同的酶分子。Liu 等以自组装的方式设计了一个DNA 支架，并以酶抑制剂为连接体，将DNA 链与GOD、INV和HRP三种酶定向结合在一起。然后在三种酶表面将DNA 支架移除，制备了超分子纳米酶胶囊（图5）。该固定化多酶体系的催化效率是游离酶的24 倍，且纳米胶囊能够保护酶免受外界环境的破坏，使酶稳定性显著提高。

图5 DNA自组装合成纳米多酶体系[35]

随着DNA 纳米技术的发展，出现了一种更高级的自组装方法——DNA 折纸技术。它是通过复杂的空间设计合成二维或三维的DNA 折纸纳米结构，并以此作为载体来实现多酶的定向固定化。其中，最为经典的是Wilner等通过自组装技术设计了一个六边形的DNA 骨架（图6），用于将GOx和HRP 定向固定化。实验发现，该反应体系的活性与DNA 骨架的拓扑结构有关，可以通过对DNA链进行设计来控制双酶的相对位置，从而调节该体系的最大催化活性。相似地，Fu等利用该技术合成了DNA纳米砖（图7），用于固定化HRP和GOx，并探究了两酶的间距（10～65nm）和位置对酶活性的影响。结果表明，DNA 折纸上固定化酶的酶活普遍大于游离酶，且两酶间距为10nm时DNA固定化酶的酶活最高（约为游离酶的4 倍），该研究对解释酶活与位置的相关机理具有重要意义。

图6 GOx和HRP在“二六边形”和“四六边形”上的固定化[37]

图7 GOx和HRP在DNA纳米结构上的自组装[38]

不难看出，DNA 定向固定化技术在提高酶活方面效果显著。这一方面得益于DNA 分子优良的生物相容性和精确的定位能力，避免了多酶分子之间的堆积重叠，保证酶活性位点的充分暴露；另一方面，由于DNA 结构具有可设计性，能够方便地调节多酶的比例、多酶之间的距离以及不同酶分子的空间取向，对整体酶活具有显著促进作用。

综上所述，新型固定化技术具有温和、高效、精确定位等特点，因此通常比传统固定化技术具有更好的催化活性。然而，由于生物标签试剂和DNA 链的操作要求及应用成本都相对较高，其普适性还有赖于生物技术和DNA技术的进一步发展。目前，新型固定化技术多用于医学检测、生物分析及传感器等少数领域，而对于一般的多酶催化体系并不常用。

2 多酶共固定化技术在糖类催化中的应用

多酶共固定化技术在糖类催化中的应用源于20 世纪中期。起初，人们主要关注于共固定化细胞对糖类的催化作用，后来又开始探索多种新型固定化方法，其部分应用如表2所示。目前，多酶共固定化技术发展日渐成熟，在糖类催化中的应用也非常广泛，常见的有淀粉的水解、纤维素的利用以及功能性糖的合成等。

表2 多酶共固定化技术在糖类催化中的应用

2.1 多酶共固定化技术在淀粉水解中的应用

淀粉是我国产量最多的可再生能源之一。该行业正面临着初级产品用量过剩、经济价值低的困境，而其水解产物葡萄糖、麦芽糖等应用极为广泛，在食品、医疗、化工等行业发挥着不可或缺的作用。利用多酶共固定化技术对淀粉进行酶解，使其转化为高价值产品，推动行业转型升级，已成为当今发展的必然趋势。

共价法和交联法是淀粉催化中常用的多酶共固定化方法。Torabizadeh等以戊二醛为交联剂，将α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶共固定在赖氨酸改性的磁性FeO纳米颗粒上，用于催化淀粉转化为麦芽糖。与游离酶相比，该固定化双酶保留了84%的活性，在95℃催化时的值降低了1.5倍，热稳定性增加了1.5倍，且重复使用10个循环后仍可保留80.4%的原始活性。这种具有高稳定性和重复使用性的纳米生物催化剂具有实际生产价值，为淀粉转化为麦芽糖的工业生产提供了有效方案。相似地，Talekar 等以2%的戊二醛为交联剂，将葡萄糖淀粉酶和普鲁兰酶共固定化，在间歇条件下，淀粉水解的转化率为100%，重复使用8 次后两酶分别保留90%和85%的活性。在此基础上，该课题组用同样的方法制备了三种酶（α-淀粉酶、支链淀粉酶和葡糖淀粉酶）的交联聚集体，并比较了不同多酶体系混合物的催化效果。结果表明，多酶交联聚集体的转化率（100%）比单酶交联聚集体混合物（60%）、游离酶混合物（40%）高很多，并且重复使用5个循环活性不发生明显变化。

与共价法相比，包埋法在操作上更为简单方便。Zhang 等受线粒体内代谢酶空间结构和贻贝黏附蛋白多功能特性的启发，通过层层组装的方式，将葡糖苷酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶和共包埋于多巴胺（PDA）微囊的不同位置（图8）。用于催化淀粉水解为葡萄糖。由于PDA 微胶囊固有的传质阻力，固定化多酶的催化速率要比游离酶慢。但是，其最大产率（53%）大于游离酶（39%），这是因为PDA 的亲水性和良好的生物相容性为多酶级联体系提供了一个合适的反应微环境，从而提高了整体催化活性。Salgaonkar 等用一锅共沉淀法制备了淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的复合金属有机骨架（MOF），用于将淀粉转化为葡萄糖。基于MOF的支撑保护作用，该固定化酶复合物具有良好的稳定性，在储藏24 天后仍保留89%的活性，远高于游离态。

图8 多巴胺微胶囊构建的固定化多酶体系[47]

在载体比表面积较大的情况下，吸附法也是一种较好的选择。Han等以多孔微球作为载体，利用吸附法共固定化α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、肌醇1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，用于催化淀粉合成肌醇。该共固定化多酶体系的催化速率与游离酶相当，且具有更高的热稳定性，使用7个批次后仍保留45.6%的相对产率，而游离酶3 个批次后仅保留13.3%的相对产率。这种多孔微球共固定化酶可用于生物制造，对体外合成酶系统的工业应用具有重要意义。

除单一固定化法外，还可以将多个方法结合使用。Dai将包埋法和吸附法联用，使葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶分别固定于藻酸钙珠粒的内表面和外表面，两酶的固定效率分别为45%和54%。这种固定化策略可以通过减少中间过程的繁杂步骤数来提高淀粉水解过程的效率，从而降低酶费用及加工成本。

综上所述，对于淀粉水解的多酶体系，共价固定法最常用。虽然共价固定后的多酶催化体系活性有所损失，但仍保持了高效的催化效率和良好的稳定性，具有工业化应用的潜力。包埋法和吸附法能较大程度地保留淀粉酶的活性，但是由于存在底物传质限制和酶易脱落的问题，催化效率和操作稳定性往往不如共价固定化法。

2.2 多酶共固定化技术在纤维素处理中的应用

木质纤维素可以形成大部分植物的细胞壁和结构组织，是全球最丰富的可再生农业原料，其主要成分是纤维素。在过去几十年中，随着各工业部门对水解纤维素产品的需求量增加，纤维素酶的应用引起了广泛关注。在纤维素的水解过程中，往往需要多种酶协同催化才能获得目的产物，然而游离酶体系往往成本高、稳定性差且难以回收。因此，在实际工业应用中，将多种游离纤维素酶进行共固定化以提高生产效益是十分必要的。

Cho 等以金纳米粒子作为载体（AuNP），共固定半胱氨酸标记的三种纤维素酶（内葡聚糖酶、外葡聚糖酶、β-葡糖苷酶）用于催化纤维素水解（图9）。结果表明，该固定化体系的活性和稳定性显著高于游离纤维素酶混合物。在进一步研究中，将这三种酶固定在金-二氧化硅复合纳米粒子上（Au-MSNP），用于连续生产葡萄糖。研究发现，由于SiO的存在减少了金纳米粒子间的相互作用，Au-MSNP@纤维素酶具有更好的催化效率，生成的纤维二糖和葡萄糖的产率分别增加了158%和179%，且在重复使用7 次后仍保留90%的催化活性。

图9 在AuNP和Au-MSNP上固定化纤维素酶[52]

相似地，Yuan 等用磁性纳米粒子共固定化三种纤维素酶，水解植物细胞壁的纤维素以回收花青素。固定化酶显示出优越的稳定性和重复使用性，即使在储存60 天后，几乎保持所有的催化活性，而游离酶在30 天内失去全部活性。此外，还表现出良好的催化能力，可用于回收5 种花青素，降低了工业应用酶的成本。

Muley 等利用溶剂沉淀法从发酵液中回收纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，然后以戊二醛为交联剂，将这三种酶共固定在APTES 改性的FeO纳米粒子上。三种酶的酶活回收率分别为80.25%、84.76%和75.62%，与游离酶相比具有更好的热稳定性和储存稳定性，最适温度由50℃升高为60℃，在5℃下可以稳定保存36 天，且在循环使用4次后仍可保留90%以上的催化活性。这种磁性多酶复合物性能优良，已成功用于黑胡椒中胡椒碱的提取、甘蔗细胞原生质体的制备以及木瓜汁的澄清等。与之相似，Kumari 课题组以FeO纳米粒子作为载体，共固定化木聚糖酶、纤维素酶和淀粉分解葡聚糖转移酶。实验结果表明，三种酶的固定效率分别为92%、45%和93%。制备的共固定化多酶在4℃下储存45天可以保持66%的催化活性，重复利用13 次后仍具有50%以上的活性。该多酶复合物也可用于农业废弃物的处理，将生物质中的纤维素或半纤维素转化为不同种类的单糖，或进一步处理转化为乙醇等染料。

纤维素水解中的酶体系大多都是由不同类型的纤维素酶构成的。与游离酶相比，共固定化后的多酶体系表现出明显的优势，即具有非常好的储存稳定性和良好的重复使用性，这在一定程度上为工业化生产奠定了基础。

2.3 多酶共固定化技术在功能性糖合成中的应用

功能性糖是对人体健康有改善促进作用的一些糖类，主要包括功能性低聚糖、功能性膳食纤维和功能性糖醇。功能性糖可以作为蔗糖的替代品，不仅具有抗龋齿、降血压、保护肠道的生理功效，还能预防癌症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病等多种疾病的发生。目前，利用多酶级联催化法制备功能性糖是一种绿色高效的途径。

低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性寡糖，可促进肠道菌群的生长，是最有前途的益生元之一。Li 等将β-半乳糖苷酶固定在海藻酸钙上，催化乳糖生成低聚半乳糖。在此基础上，进一步用固定化的酿酒酵母细胞对产物进行反复纯化，获得了高纯度的低聚半乳糖。但是由于两部分固定化过程是分开进行的，这种方法在操作上较为烦琐且获得的产率较低。近些年，Aburto等也对该催化体系进行了研究，但制备固定化酶的方法与Li课题组大不相同。简单来说，先制备β-半乳糖苷酶的交联酶聚集体，然后将其与酿酒酵母细胞共固定在海藻酸钙凝胶中。结果表明，酶和细胞的共固定化复合物不仅易于回收和重复使用，而且获得了与游离酶（23.3%）相当的产物收率（25.7%），是一种从乳糖中提取低聚半乳糖的创新工艺。然而，由于酵母细胞在操作过程中易失活，使催化性能受到限制，所以需进一步改进工艺以提高酵母细胞的稳定性。

低聚乳果糖是另一种促进肠道菌群增殖的功能性糖，可以作为甜味剂食用，在食品行业应用广泛。Long 等用溶胶-凝胶法共固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶，用于催化蔗糖/乳糖混合液生成低聚乳果糖。与游离酶相比，该固定化双酶体系具有85.3%的初始活性和较好的操作稳定性，在使用15 次之后仍保留78.5%的活性。这种共固定化双酶体系的低聚乳果糖的产量高达160.8g/L，可用于食品工业中高纯度低聚乳果糖的连续生产。

低聚异麦芽又称益生元，具有促进消化吸收、增强免疫力、降低血脂的功能。Ölçer 等用海藻酸钙胶囊法共固定化葡聚糖蔗糖酶（DS）和葡聚糖酶（DN），并以蔗糖为原料制备低聚异麦芽糖。该法简单有效，不仅具有较高的固定化效率（71%），在重复使用20 个循环或储存一个月后仍可保持其催化活性，具有工业化生产低聚麦芽糖的潜力。

2.4 多酶共固定化技术在糖类下游产品合成中的应用

糖类的催化产物经进一步加工，还可转变为多种化合物，不仅可用于补充人体营养物质（如小分子糖、微量元素等），还可以作为工业生产的原料，广泛地用于各行各业中。

5-羟甲基糠醛是一种以糖类为原料合成的有机物，其化学性质活泼，可以通过氧化、氢化和缩合等反应转化为多种化学品或液体染料，应用极为广泛。Wu 等将半乳糖氧化酶、过氧化氢酶和辣根过氧化物酶共固定化在Cu(PO)纳米花中，构建了一条由5-羟甲基糠醛生成2,5-二甲酰基呋喃的“绿色路线”。研究发现，游离酶易受高浓度的5-羟甲基糠醛影响而失去活性，但共固定化三酶表现出更好的底物耐受性和热稳定性。此外，共固定化三酶催化生成2,5-二甲酰基呋喃的产率（95.7%）是单独固定化酶（90.4%）的1.06 倍，这是因为三酶的共定位减少了底物传输的距离，促进了级联反应的有序进行。在以后的研究中，可以进一步将化学催化法和多酶共固定化技术相结合，探究将木质纤维素直接转化为2,5-二甲酰基呋喃的高效路径。

葡萄糖酸是一种多功能有机化工产品，其盐类可广泛应用于制药、农业、食品、医药和混凝土行业。据报道，糖类的酶法催化是生产葡萄糖酸的有效途径之一。Han 等用纤维素酶水解脱木质素的玉米棒残渣（DCCR），进而在共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的催化下，生成葡萄糖酸钠。该固定化酶在最佳条件下反应56h 可得166.87g/L 葡萄糖酸钠，产物收率为98.24%，重复使用6次后仍能保持60%以上的催化活性。在此研究的基础上，Yu 等将纤维素酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶三种酶共固定在Eudragit L-100 上，用于生成葡萄糖酸。通过确定制备条件、探究酶学性质和优化催化条件，最终生成的葡萄糖酸的产量达0.28mg/mg，玉米秸秆中纤维素的转化率为61.41%。该共固定化多酶系统适用于将玉米秸秆一锅转化为葡萄糖酸。

木糖酸是维他命C的重要代谢产物之一，也是许多重要化学过程必不可少的中间体。Bachosz等利用磁性纳米粒子共固定化木糖脱氢酶和乙醇脱氢酶，用于将木糖转变为木糖酸，并使原位辅因子再生。共固定化酶生成的木糖酸浓度比游离酶高25%，并具有良好的稳定性和重复使用性：保存20天后活性保留了60%左右，连续5个反应循环后活性仍大于65%。

乙醇是重要的生物质燃料和化学溶剂，广泛用于医疗卫生、食品工业、国防化工等行业。Altuntas 等将淀粉葡糖苷酶和运动发酵单胞菌细胞共固定在海藻酸钠凝胶中，以廉价的淀粉作为底物，在连续搅拌的生物反应器中同时糖化和发酵生成乙醇。该生物催化剂具有较好的反应活性，在最佳条件下，底物转化率可达98%。与此不同，Silva小组先将葡萄糖异构酶固定在壳聚糖上，然后再进一步与酿酒酵母共固定于藻酸钙凝胶中，在连续生物反应器中将木糖转化为乙醇。实验结果表明，该共固定化多酶具高蛋白负载量（0.03～0.068g/g）、高产物收率（约100%）和高酶活回收率（>90%），且最佳活性几乎是商用酶的2倍，可满足由木糖为底物连续生产乙醇的需要，具有工业应用的潜力。

2.5 多酶固定化技术在人工光合作用中的应用

二氧化碳是导致温室效应的主要气体之一。从资源利用和能源合成的战略角度来看，利用可再生能源将二氧化碳转化为化学品具有重要意义，不仅能够减少碳排放缓解温室效应的危害，而且可以将低价值的化合物转化为具有高附加值的产品。近年来，随着多酶级联系统的迅速发展，人工光合作用应运而生，通过利用每种酶的特性和多酶之间的协同效应，将CO高效地转化为一些重要的化学原料，如甲醛和甲醇等。因此，人工光合作用作为一种创新型方法，近年来受到研究者的广泛关注。

Huang基于胞外酶工程原理，通过组合自然界存在的多种酶，催化自然界不存在的暗反应途径。该过程使用H或电能再生NADH驱动CO转化为糖或淀粉，避开了人工光合磷酸化再生ATP 的难题，理论效率较高。如果进一步与太阳能光伏技术或者产氢技术结合，就能实现人工光合作用，将CO转化为了糖类，成为一种工业粮食生产的潜在方法。该研究具有理论创新性，但其催化过程存在酶稳定性的问题。多酶共固定化技术可以很好地改善这一困境，即通过对反应过程中的多种酶进行固定化操作，使酶的稳定性和反应转化数显著提高，进而提高糖类产率。因此，基于多酶共固定化技术的原理，Zhou等设计了一种新颖的方案，通过将中-四（羧基苯基）卟吩（TCPP）和ZIF-8 成功结合在一起，以TCPP 用作光催化剂，ZIF-8 作为甲醛脱氢酶（FaldDH）和甲酸脱氢酶（FateDH）的固定化载体，首次构建了光催化多酶级联仿生固碳系统（图10）。结果表明，1g/L 3%的TCPP@ZIF-8在可见光下反应3h，可使NADH 的还原率高达75.04%，且当FateDH∶FaldDH=2∶1 时，甲醛产率为7.74μmol/L。此外，该复合体系经过10 批次重复使用后，可保留52.93%的催化活性。这是人工光合作用研究中的一次创新，为人工催化体系与多酶固定化体系的结合提供了实践基础。

图10 光催化多酶级联系统示意图[82]

3 总结与展望

糖类是天然的可再生能源，其催化产物具有巨大的应用潜力。在过去十几年里，多酶共固定化技术迅速发展，在糖类的催化反应中应用广泛，如多糖的水解、功能性寡糖的合成以及糖类下游产品的合成等，越来越受到研究者的关注。

诚然，多酶共固定化技术具有诸多优势，不仅使酶分子具有良好的稳定性和重复利用性，同时充分发挥了多酶之间协同催化的性能，提高了催化效率。然而，需要指出的是，由于糖类的结构繁多，多酶催化体系复杂，并没有一种通用的、普适性的方法可供使用，对于某一已知的催化体系，要综合考虑其实际情况，理性地选择合适的方法。此外，多酶共固定化技术在实际运用中会出现很多问题，如固定化后酶活损失严重、酶与载体结合不牢固，产物回收率低等。针对以上不足，无论在以后的基础研究还是应用研究中，应注意以下几个方面：①在固定化过程中，要充分考虑多种因素，选择一种最佳的固定化方案，以最大限度地保留酶活并提高反应系统的稳定性；②对于共固定化后传质受限的多酶体系，可为其针对性地选择合适的载体，充分利用底物通道或微环境提高级联反应的催化效率；③若多酶体系中含有固定化细胞，要设法改变其操作稳定性，以提高整体的操作稳定性和重复使用性；④在一些情况下，可将多种方法联合使用以提高固定化酶的性能；⑤灵活利用多种表面分析技术对固定化过程的有效性进行检测。

目前，多酶共固定化技术在糖类催化中的工业应用还比较少，主要是因为酶成本比较高以及固定化技术的工业应用还不够成熟。在今后，多酶共固定化技术会面临更多新挑战和发展机会，相信随着科学研究的不断深入，技术的不断优化，多酶共固定化技术将日益成熟完善，并在糖类催化的实际应用中发挥巨大的作用，为工业生产带来一次巨大蜕变。