N6-甲基腺嘌呤修饰在黑色素瘤中作用的研究进展▲

江晓梅 谢万著 黄少君 严 瑶 曾文俊 唐红珍 李芳梅

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530001，电子邮箱：1622232545@qq.com；2 广西国际壮医医院皮肤科，南宁市 530001)

【提要】 N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰是真核生物mRNA的修饰之一，是一个复杂的过程。多个m6A相关蛋白参与黑色素瘤发病的调控，这些蛋白对黑色素瘤的发生、发展及耐药有着重要的影响。本文对m6A修饰参与调控黑色素瘤的分子机制作一综述，以期为黑色素瘤相关m6A修饰研究提供新的思路。

黑色素瘤是来源于黑素细胞、恶性病变程度较高的肿瘤，具有高度的侵袭性，且易发生早期转移。近年来，黑色素瘤的发病率以3%～5%的年增长率迅速上升，且发病趋于年轻化，黑色素瘤病死例数占皮肤类癌病死总例数的65%以上[1]。大多数早期黑色素瘤患者的手术治愈率较高，但晚期患者预后较差，生存率较低[2]。探索黑色素瘤的发生、发展、耐药机制，对寻找新的诊断指标及治疗方法具有重要意义。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰是指发生在mRNA、长非编码RNA、转移RNA等RNA的腺嘌呤上的甲基化修饰。m6A修饰为识别和调节RNA中的化学修饰，包括甲基转移酶、去甲基化酶及甲基识别蛋白，通过调节RNA代谢、功能和定位对基因表达产生影响[3]。m6A修饰通过甲基转移酶蛋白实现甲基化[4]。近年来研究表明m6A修饰参与多种人类疾病的发生和发展过程，其中m6A修饰可以通过调节癌基因和抑癌基因的mRNA表达水平来影响肿瘤的发展[5]。目前m6A修饰调控黑色素瘤的相关研究仍然有限。本文对m6A修饰与黑色素瘤发生、发展之间的关系，以及m6A修饰在肿瘤耐药中的作用作一综述，以期为黑色素瘤的治疗提供新策略。

1 m6A修饰概述

m6A修饰是哺乳动物最常见的内部RNA修饰，包括mRNA前体剪接、易位及稳定性，从而调控mRNA的翻译。m6A修饰由RNA甲基转移酶复合物催化，该复合物由甲基转移酶样蛋白(methytransferase-like protein，METTL)3及其相互作用的蛋白组成，后者包括METTL14、剪接因子维尔姆斯瘤1相关蛋白(Wilms′tumor 1-associating protein,WTAP)、新蛋白[病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(vir like m6A methyltransferase associated protein,VIRMA)]和其他尚未鉴定的蛋白。m6A的去除由RNA去甲基化酶脂肪量与肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein,FTO)以及烷基化DNA修复蛋白AlkB同系物(alkylated DNA repair protein AlkB homolog，ALKBH)5催化。m6A结合蛋白，即含YTH结构域的蛋白[如含YTH结构域的家族蛋白(YTH domain-containing family protein,YTHDF)1、YTHDF2和YTHDF3]可以特异性结合修饰的RNA并影响其稳定性和翻译。m6A修饰除了在干细胞分化、精子发生和应激反应等关键过程中发挥调节核糖核酸代谢的生理作用，在肿瘤的发生和发展中也具有重要作用[6]。

m6A甲基转移酶复合物可以催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)的甲基转移至腺嘌呤第6位氮原子上，其中METTL3、METTL14定位在细胞核的亚细胞器—核小斑，并且间接调节WTAP，这是一种独特的核定位模式[7]。研究显示METTL3是一种SAM结合蛋白，是m6A甲基转移酶复合体的核心成分;其识别潜在的m6A位点，并将附着在SAM上的甲基转移到这些位点上，通过多种途径影响癌症的发生[8]。METTL14虽然与METTL3同源，但是缺少酶的催化结构域，被认为是为提高METTL3催化活性提供RNA的结合平台。WTAP也不具备酶的活性，其主要功能是帮助METTL3和METTL14复合体定位到核小斑[9]。然而METTL3作为最主要的m6A甲基转移酶,仅仅结合约22%的m6A位点[10]。随着研究的深入，METTL16、ZC3H13、KIAA1429、 RBM15和CBLL1等甲基转移酶陆续被发现[11]，并且在m6A修饰中起着重要作用。例如METTL16可结合于U6 snRNA，导致U6第43位的腺嘌呤发生m6A甲基化修饰，从而影响U6对mRNA前体的剪接[12]。

去甲基化酶主要由ALKBH家族组成，包括ALKBH1-8、FTO。ALKBH家族最突出的特点是依赖Fe2+和α-酮戊二酸结构域进行底物催化[13]。有学者发现，FTO可通过调节mRNA的m6A的甲基化水平，影响mRNA的稳定性及翻译过程[14]；ALKBH5对特定基因的m6A修饰位点去甲基化，参与多种疾病的发生和发展。

m6A修饰的阅读蛋白主要包括YTHDF蛋白家族。m6A修饰在细胞质转录水平的作用主要依靠YTHDF家族特殊的结合位点及其一些网络机制来实现[5,15]，其中YTHDF1与YTHDF3的结合位点主要分布在mRNA的3′端非编码区和终止密码子[16-17]。既往观点认为甲基化位点的转化过程只要甲基化的底物转录发生甲基化，都可以被阅读蛋白(YTHDF等)家族成员识别，并且m6A修饰的多种效应与甲基化位点不存在密切的联系[18-19]。最近有研究结果显示，对于甲基转移酶的共有基序RRACH而言，其甲基化位点主要发生在终止密码子周围，但m6A特异位点聚集在5′端非编码区至转录起始位点的区域[20]。有实验表明，m6A被阅读蛋白酶YTHDF2识别后，通过选择性地结合mRNA的衰减位点以影响mRNA的翻译状态和衰亡[21]。这些研究结果提示甲基化的特异位点与共有位点有所差异。此外，有学者发现某些mRNA能够以相似的方式识别并结合YTHDF家族的3种同源蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)，3种同源蛋白可结合相同的mRNA以促进mRNA的翻译和降解[22]。YTHDF1～3主要存在于细胞质，其中YTHDF1在多种肿瘤中过度表达，免疫组织化学染色显示其表达与多种恶性肿瘤行为有关，如肿瘤浸润深度、淋巴结转移和肿瘤分期等[3]。

2 m6A修饰与黑色素瘤的发生和发展之间的关系

目前，在肿瘤发生及发展机制的生物学研究中，m6A修饰已成为研究热点之一。在黑色素瘤的发生和发展中，m6A修饰起着关键性的作用。m6A相关蛋白的异常表达可导致黑色素瘤细胞的增殖、转移、侵袭及耐药。m6A修饰与黑色素瘤的主要关系见图1。

图1 黑色素瘤中的m6A修饰及其调节蛋白

2.1 甲基转移酶 黑色素瘤早期容易发生转移，因此针对m6A修饰如何调控肿瘤细胞的转移、增殖进行研究有重要的意义。METTL3作为癌基因，在人类癌症中起致癌和抑癌双重作用，其可通过调节关键转录底物的m6A甲基化水平来促进多种癌症的发生和发展[23]。例如，METTL3在人类肝细胞癌组织中表达显著上调，且敲除METTL3可抑制体外培养的肝细胞癌细胞增殖，以及体内致瘤性和肺转移[24]。有学者发现，METTL3在人类黑色素瘤组织中表达上调，从而激活了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2，促使c-Met、p-Akt蛋白的表达，导致黑色素瘤细胞集落形成，最终引起黑色素瘤细胞侵袭[25]。细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-Met)是一种细胞表面酪氨酸激酶，是多种癌症发生的驱动因子，除了受miRNA调节外，也直接受RNA m6A修饰的调控。有研究表明在罕见的黑色素瘤-葡萄膜黑色素瘤中，METTL3表达上调介导了c-Met/蛋白激酶B信号通路的激活从而影响葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖[11]。由此可见，METTL3可以促进黑色瘤细胞的增殖及转移，因此敲除METTL3可抑制肿瘤细胞的增殖及转移，而监测METTL3的表达情况，对肿瘤的预后有着重要的意义。

2.2 去甲基化酶 FTO是第一个被发现的m6A去甲基化酶，表明m6A修饰的RNA甲基化是可逆的，且呈动态变化，因此具有重要的生理和病理功能[26]。FTO是黑色素瘤的一种原生因子，黑色素瘤中的FTO表达水平增加，机体通过自噬和核因子κB途径诱导FTO表达，以及影响m6A RNA修饰及其去甲基化酶活性，从而调节其靶基因程序性死亡蛋白1(programmed death protein 1，PD-1)的表达，进而促进肿瘤的发生和发展。在有关黑色素瘤的体外实验研究中，敲除FTO基因后，机体可通过γ-干扰素调节组织中PD-1、C-X-C基序趋化因子受体4和SRY盒转录因子10的水平，诱导巨噬细胞对黑色素瘤细胞的杀伤作用，进而增强机体对抗PD-1阻断的反应[27]。

此外，去甲基化酶ALKBH5的表达也与致癌或抑癌作用有关，例如，敲除ALKBH5可通过降低叉头盒转录基因M1的m6A修饰水平来抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭；ALKBH5可通过改变Wnt抑制因子1的表达来抑制胰腺癌转移[28]。但ALKBH5在人类癌症中的潜在机制尚未完全清楚[29]。在人黑色素瘤细胞中ALKBH5可调节靶基因单羟酸转运蛋白4/单羟酸转运蛋白3的表达和剪接，ALKBH5可通过调节肿瘤微环境的乳酸浓度和血管内皮生长因子α的积累来调节免疫抑制性骨髓间充质干细胞和调节性T淋巴细胞的募集，从而促进肿瘤生长。

2.3 m6A结合蛋白 在黑色素瘤中，YTHDF1起到抑癌作用。HINT2是甲基识别蛋白家族的靶点，作为抑癌基因其可促进肿瘤细胞凋亡和死亡，经YTHDF1的识别可以促进眼黑色素瘤抑制基因HINT2甲基化的翻译过程，从而抑制细胞生长和迁移[30]。有研究发现，与正常对照组织相比，眼黑色素瘤组织、细胞中HINT2 mRNA的m6A修饰减少，HINT2蛋白表达下调[30]。

3 m6A修饰与黑色素瘤耐药性之间的关系

在黑色素瘤的治疗中，耐药是导致治疗失败的原因。最新研究表明m6A修饰在抗肿瘤的免疫治疗中影响免疫反应和黑素瘤细胞敏感性[31]。深入研究m6A修饰与黑色素瘤耐药的分子机制，可指导临床用药。

黑色素瘤细胞中METTL3/METTL14的缺陷促进了IFN-γ-Stat1-Irf1炎症信号传导，从而增加肿瘤微环境中的CD8+T淋巴细胞的数量，以及IFN-γ、Cxcl9和Cxcl10趋化因子的分泌，增强黑色素瘤对抗PD-1治疗的敏感性[32]。Li等[33]研究发现，ALKBH5的缺失，导致了肿瘤微环境中乳酸盐含量的变化，可以减少肿瘤疫苗GVAX/抗PD-1治疗期间免疫细胞亚群的募集，提高GVAX/抗PD-1治疗的功效。T淋巴细胞对肿瘤新抗原的自发启动，有利于提高临床免疫治疗的效果。但许多患者体内的新抗原识别能力不足以诱导持久的T淋巴细胞反应。有学者发现，T淋巴细胞中YTHDF1的缺失，增强了CD8+T淋巴细胞的主要抗原递呈细胞，即树突状细胞的交叉启动能力，促进T淋巴细胞识别肿瘤新抗原，从而启动早期细胞免疫[34]。另有研究表明，YTHDF1蛋白高表达与肿瘤恶性程度有关，表达程度越高，则患者预后越差，敲除YTHDF1后，肿瘤细胞对氟尿嘧啶和奥沙利铂的敏感性明显增高[35]。但目前m6A结合蛋白与黑色素瘤免疫耐受之间关系的研究报告相对较少。

4 总结与展望

m6A修饰是mRNA中最常见的修饰，广泛存在于真核生物，具有动态可逆性的特点，几乎参与了mRNA的产生到降解的整个生物学过程。m6A修饰是一把“双刃剑”，主要通过调节癌基因或抑癌基因的mRNA水平来促进或抑制肿瘤的发生和发展。它可以调节肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、分化，提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。随着对m6A作用机制研究的深入，其生物学过程或可被详细揭示。但在黑色素瘤的发病中，m6A的甲基化功能和作用机制尚未完全清楚。进一步研究m6A的甲基化功能及其调控因子的分子机制，可以为黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供依据。

免疫抑制剂在黑色素瘤的治疗中取得了重大的突破，使越来越多的黑色素瘤患者受益，但耐药性的出现又导致疗效不佳。m6A修饰可经过多条通路调控黑色素瘤对免疫抑制剂的耐药性，m6A相关蛋白有可能成为控制肿瘤耐药性的新靶点，且随着新m6A修饰组分的发现，m6A甲基化对肿瘤耐药性的研究将得到进一步发展。