辣椒彩色斑叶突变体叶片显微结构及超微结构研究

王 萌，赵 虎，赵曾菁，孟生德，吴 星，王日升*

(1 广西壮族自治区农业科学院 蔬菜研究所，南宁 530007；2 甘肃省敦煌种业集团股份有限公司，甘肃酒泉 735099)

叶色变异呈现金心、银边、网纹、彩叶、斑叶等特征是常见的突变性状之一，这些植物多用于园林绿化和庭院美化，还可用于光合作用、光形态建成、叶色表达、遗传转化和农作物种子杂种纯度鉴定等科学研究，具有重要经济价值和科学价值。国内外研究认为叶片结构变化、叶绿素、类胡萝卜素、花色素苷的含量、比值以及在叶片中的分布均可造成叶色变异，叶色突变体的叶绿体发育、形态结构、数量常发生变化进而影响叶片的光合作用[1]。杜文文等[2]研究了古林箐秋海棠叶斑结构对叶色的影响，发现斑区叶绿素含量比非斑区略低，斑区上表皮与栅栏组织细胞间的空隙是造成该区域相对周围正常叶片区域偏白的原因。邱东萍等[3]研究了羽衣甘蓝、花叶扶桑、红花檵木等 8种园林彩叶植物的叶片结构及其显色部位，结果发现显色部位不同是造成8种彩叶植物叶色各异的原因。戴斌等[4]研究表明，辣椒紫色叶片中的色素主要为花色素苷，且至少有两种不同成分，花色素苷在叶片中主要存在于栅栏组织中是造成叶片正反面异色的原因。杨莎等[5]研究辣椒黄化突变体、钟淮钦等[6]研究3种杂交兰叶艺性状中均发现，叶片中叶绿素、类胡萝卜素含量显著降低。辣椒叶色比较丰富，前人研究了黄化叶[5]、紫色叶[4]的遗传及生理特性、色素含量、分布等，但辣椒彩色斑叶突变体或彩色花叶突变体(非感染花叶病毒)的相关研究尚未见报道。

基于彩色斑叶辣椒突变体叶片呈现彩色斑驳这一现象，本研究以正常紫叶辣椒(图1，A)、白色斑叶辣椒突变体(图1，B)为对照材料，进行彩色斑叶辣椒突变体显微结构及超微结构观察，研究叶斑、花色素苷在叶片的分布、细胞器的数量与结构变化特征，拟在细胞水平上解释彩色斑叶辣椒复杂叶色的成因。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所使用的彩色斑叶辣椒突变体为广东省农业科学院蔬菜研究所徐小万研究员惠赠，因彩色斑叶辣椒突变体具有紫色和白色的斑块(图1，C)，斑块的部位和颜色深度在群体内甚至同一植株不同的枝条上都呈现着色不均匀现象(图1，C)。为揭示彩色斑叶辣椒突变体彩色叶斑的成因，本研究以课题组保存且遗传稳定的紫叶辣椒、白色斑叶辣椒突变体为对照试材(图1)开展研究，紫叶辣椒为资源收集获得的叶片呈紫黑色的一份非突变型的辣椒材料(图1，A)；白色斑叶辣椒是田间获得的一份自然突变体材料，该突变体叶色呈现白绿斑驳(图1，B)，因白斑特征与彩色斑叶辣椒斑块(图1，C)特征近似，所以也被选为对照材料。3份试材均种植于本单位的里建科研基地内。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片显色特征观察从子叶期开始观察叶片显色时期、显色部位、显色特征以及斑块发生时期、位置、大小等特征。

1.2.2 显微结构观察采摘3种辣椒功能叶，采用双刀法制作徒手切片，观察叶片不同显色部位的叶肉细胞及结构；用镊子分别撕取叶片上下表皮制作临时切片，观察叶片不同斑区的表皮细胞、气孔保卫细胞等，并拍照。

A.紫叶辣椒；B.白色斑叶辣椒突变体；C.彩色斑叶辣椒突变体；D. 着色不均的彩色斑叶辣椒突变体图1 试验材料A. Purple leaf pepper; B. Pepper mutant with white spot leaf; C. Pepper mutant with color spot leaf; D. Pepper mutant with color spot leaf of uneven coloringFig.1 Test materials

1.2.3 超微结构观察采摘白色斑叶辣椒突变体和彩色斑叶辣椒突变体功能叶，在紫叶辣椒叶脉两侧、白色斑叶辣椒绿斑区以及彩色斑叶辣椒白斑区、绿斑区、紫斑区用刀片分别取样，样品尺寸约1 mm×1 mm，迅速投入2.5%戊二醛固定，真空泵抽气直至沉底，室温放置2 h，4 ℃保存。透射电镜超薄切片制作参考王振兴[7]，包埋调整为使用 812包埋剂包埋，染色调整为2%醋酸铀饱和酒精溶液和枸橼酸铅双染色，各染色15 min，使用HT7700透射电镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 叶片显色特征

田间观察可以得知，彩色斑叶辣椒突变体子叶为紫黑色，自第一片真叶展开后，开始出现异色斑块，斑块随着叶片生长逐渐扩大，在幼苗期、始花期、盛果期等不同时期叶片颜色显色稳定，没有出现“返绿”现象。通过田间观察对比3种试验材料的显色特征(表1)发现，紫叶辣椒新叶为绿色，随着叶片生长，花色素苷快速在叶片上表皮积累，从而导致叶片呈现紫黑色(图1，A)；辣椒白色斑叶突变体自真叶期叶片开始显现叶斑，叶斑呈白色、乳白色，叶斑延伸至叶片绿色部分则呈现浅绿色(图1，B)；辣椒彩色斑叶突变体自真叶期叶片开始显现叶斑，叶斑呈白色、乳白色、紫色、浅紫色，白斑延伸至叶片绿色部分则呈现浅绿色，紫斑延伸至叶片绿色部分则呈现紫黑色，紫色斑块和白色斑块的形状不规则，斑区界限不清晰、色彩往往混杂在一起(图1，C)。

表1 3种辣椒材料的叶片显色特征对比

观察彩色斑叶辣椒叶片斑块显现位置特征发现不同植株或同一植株不同枝条、不同叶片，叶斑的大小频率、色彩深度无明显规律(图1，D)。白色斑叶突变体田间观察也发现不同时期叶片显色和斑块特征有类似现象，区别是没有紫色斑块。通过与紫叶辣椒和白色斑叶辣椒叶片显色特征比对，分析得出辣椒彩色斑叶突变体叶片的基本色是紫色，突变导致了花色素苷分布不均，同时该突变体也发生了与白色斑叶突变体相同的白斑突变，白斑位置随机出现和紫色深浅不同均受环境影响。下述彩色斑叶辣椒的斑区以主要色彩进行区分。

2.2 显微结构观察

从显微观察结果对比(表2)和图2看出，彩色斑叶辣椒突变体叶片完全失绿的白色斑区叶肉细胞大部分呈现白色，栅栏组织和海绵组织难区分(图2，A1)，表明叶肉细胞内叶绿体大量缺失；如果该区域积累了大量的花色素苷，则细胞紫红色、近球形(图2，A2)；绿色为主的部位栅栏组织和海绵组织较易区分，大部分叶肉细胞呈现绿色，可观察到部分栅栏组织、海绵组织呈现紫红色，(图2，A3)。紫叶辣椒叶片徒手切片通常可以观察到紫色的叶肉细胞分布在叶片横切面的一侧，不易看清栅栏组织和海绵组织(图3，A1)，切片非常薄时才可以清晰地观察到栅栏组织，确定紫红色的叶肉细胞属于栅栏组织(图3，A2)，此外，紫叶辣椒叶片正面紫色，背面为绿色也可以验证该观察结果。紫叶辣椒显色部位显微观察结果与彩色斑叶辣椒紫色斑区观察结果不一致。白色斑叶辣椒叶肉细胞为绿色，白色斑区大部分叶肉细胞则呈现白色(图4，A)，与彩色斑叶辣椒白色斑区一致。

A. 彩色斑叶辣椒叶片横切面(10×10)：A1. 白色斑区； A2.紫色斑区；A3. 绿色斑区；B. 彩色斑叶辣椒叶片上表皮细胞(100×10)：B1.绿色斑区；B2.紫色斑区；B3.白色斑区图2 彩色斑叶辣椒突变体叶片显微观察A. Cross sections of pepper mutant with color spot leaf (10×10): A1. White spot area； A2. Purple spot area； A3. Green spot area； B. Leaf upper epidermal cells of pepper mutant with color spot leaf (100×10): B1. Green spot area； B2. Purple spot area； B3. White spot areaFig.2 Microscopic observation on leaves of pepper mutant with color spot leaf

A.紫叶辣椒叶片横切面(10×10)：A1.横切面； A2.清晰的栅栏组织；B.紫叶辣椒表皮细胞(100×10)：B1.上表皮； B2.下表皮图3 紫叶辣椒叶片显微观察A. Cross sections of purple leaves pepper (10×10): A1. Cross section； A2. Clear palisade cell； B. Leaf epidermal cells of purple leaves pepper (100×10): B1. Upper epidermis； B2. Lower epidermisFig.3 Microscopic observation on leaves of purple leaf pepper

A.白色部位横切(10×10)；B.上表皮细胞(100×10)；C.下表皮细胞(100×10)图4 白色斑叶辣椒突变体叶片显微观察A. Cross section of white spot area(10×10)；B. Upper epidermis(100×10)； C. Lower epidermis(100×10)Fig.4 Microscopic observation on leaves of pepper mutant with white spot leaf

表2 3种辣椒材料显微观察结果对比

彩色斑叶辣椒绿色斑区叶片上下表皮上有少量气孔保卫细胞呈现紫红色(图2，B1)，紫色斑区上下表皮气孔保卫细胞呈现紫红色的数量更多(图2，B2)，白色斑区上下表皮也有少量保卫细胞呈现紫红色，上下表皮细胞完全呈现白色，没有花色素苷分布的情况较少(图2，B3)。紫色辣椒叶片上下表皮上也有较多的气孔保卫细胞呈现紫红色，上表皮观察时往往可以看到紫红色的叶肉细胞(图3，B1)，下表皮则没有紫色的叶肉细胞(图3，B2)。白色斑叶辣椒叶片上表皮偶有观察到极少量呈现紫红色的气孔保卫细胞(图4，B)，通常上表皮和下表皮一样，气孔保卫细胞没有紫红色(图4，C)。叶色突变种类较多，根据叶色表型可分为白化、条纹、黄化、淡黄绿、淡绿、常绿、斑叶、紫叶、白黄和白绿等类型。Hara[8]将叶斑产生原因分为2类4种，即色素型(包括叶绿素型和色素型)和结构型(包括表皮型和空隙型)。据此，本研究彩色斑叶辣椒突变体试材同时具有花色素苷分布不均，也有叶绿素缺失，叶斑类型属于色素型。

2.3 超微结构观察

白色斑叶辣椒绿斑区、紫叶辣椒中部叶脉两侧以及彩色斑叶辣椒白斑区、绿斑区、紫斑区的超微结构显示，白色斑叶辣椒绿斑区叶片细胞结构最好，未见明显水肿(图版Ⅰ，1)，叶绿体等细胞器也未见明显异常(图版Ⅰ，2)。紫叶辣椒叶片细胞呈轻度水肿，胞质内细胞器轻度肿胀(图版Ⅰ，3)；叶绿体(Chl)数量较多，未见明显肿胀(图版Ⅰ，4)；质体小球(Pb)形状较大；线粒体(M)轻度肿胀，膜内基质变淡，嵴断裂、减少；液泡(V)局部膜破损，细胞器游离。

彩色斑叶辣椒绿斑区在所观察的三个斑区中异常程度最轻，叶片细胞呈轻度水肿(图版Ⅰ，5)；叶绿体(Chl)未见明显肿胀，其内基质类囊体连续、未见扩张，结构显模糊(图版Ⅰ，6)；线粒体(M)轻度肿胀，膜内基质变淡。彩色斑叶辣椒绿斑区与白色斑叶辣椒绿斑区超微观察细胞器无明显变化。彩色斑叶辣椒白斑区叶片细胞白化改变，中度水肿，胞质内细胞器中度肿胀(图版Ⅰ，7)，线粒体(M)中度肿胀，明显变大，线粒体膜内基质变淡，嵴减少、消失；其他各细胞器也明显异常，有少量白色体，膜结构完整，其内基质均匀(图版Ⅰ，8)。紫斑区叶片细胞也呈中度水肿，各细胞器异常明显，其中粗面内质网(RER)明显扩张，脱颗粒、空泡变；过氧化物酶体(PX)少量存在，脂滴(LD)较少(图版Ⅰ，9)，叶绿体未见明显肿胀，膜结构完整，其内片层结构排列整齐，数量丰富，基质类囊体连续、未见扩张，结构显模糊(图版Ⅰ，10)。彩色斑叶辣椒紫斑区与紫叶辣椒超微观察相比，只有线粒体和液泡结果相近，其他细胞器表现不同，不同观察部位超微结构的对比详见表3。

表3 辣椒叶片不同观察部位超微结构对比

续表3 Continued Table 3

3 讨 论

叶片颜色主要受叶片中色素种类、含量以及色素在叶片中的空间分布的影响。戴斌等[4]通过对紫色辣椒“黑珍珠”的色素进行分析，发现叶片中花色素主要存在于栅栏组织以及气孔的2个肾形保卫细胞中。嫩叶表现为绿色而略带紫色时，花色素苷仅存在于气孔肾形保卫细胞中，成熟叶呈现紫色是由于花色素苷不仅分布在气孔肾形保卫细胞中，还存在于叶肉细胞。本研究结果与戴斌相同的是彩色斑叶辣椒和紫叶辣椒也均在气孔保卫细胞和叶肉细胞内观察到花色素苷分布，紫色深浅程度主要受带有色素分布的叶肉细胞数量影响；不同的是彩色斑叶辣椒花色素苷分布不仅分布在栅栏组织，在海绵组织也有分布，花色素苷积累程度较深的紫色斑区栅栏组织和海绵组织难以区分，这可能与材料本身差异有关。

叶片白斑的显微观察报道较少，狗枣猕猴桃和古林箐秋海棠叶片白斑主要是由于叶片表皮细胞与栅栏组织或栅栏组织内存在大量间隙(气室)，入射光被大量反射导致的[7]。本研究白色斑叶辣椒和彩色斑叶辣椒叶片上均有白色不规则斑块，显微观察发现大部分叶肉细胞严重白化而呈现白色，这与王振兴、杜文文等[2]在狗枣猕猴桃和古林箐秋海棠叶斑上的研究结果不一致，原因可能是上述2种植物的叶斑存在于叶片上表面，白斑是叶片反光而发白，而本研究中辣椒叶片白斑是叶肉细胞白化造成的。

异色叶的超微结构观察主要集中在黄化、浅绿、黄绿等较常见的叶色突变体上。杨莎等[5]利用透射电镜扫描发现辣椒叶色黄化突变体叶片叶绿体数量减少和基粒片层结构减少且排列不整齐，相似的报道还有‘金叶’弯刺蔷薇[9]、斑叶银杏[10]、金叶连翘[11]、建兰[12]等。本研究中彩色斑叶突变体绿色斑区叶绿体数量没有明显减少，基粒片层丰富，基质类囊体结构模糊，这一结果与其他作物观察的结果不同，可能与作物本身突变机理不同有关。

Yang Yuxia et al[13]研究红掌粉红突变体的超微结构发现，其内叶绿体没有完整的类囊体结构，部分叶绿体被线粒体包围；在白化突变体中，叶绿体被几乎没有内部结构的囊泡所包围。黄金亮等[14]观察芽变突变体全红杨叶绿体超微结构发现，其内叶绿体形状不规则，基粒片层结构松散；叶肉细胞很多呈现空泡状。本研究中辣椒彩色斑叶突变体叶片超微结构观察发现，白色斑区未观察到叶绿体，绿色斑区和紫色斑区叶绿体未见明显肿胀，其内基质类囊体连续、未见扩张，结构显模糊，与其他作物叶色突变体观察结果不同。

辣椒彩色斑叶突变体叶色的成因是叶肉细胞内叶绿体缺失程度不一和花色素苷在叶肉细胞内不均匀分布共同导致的，叶斑类型属于色素型。研究结果初步解释彩色斑叶辣椒复杂叶色在细胞水平上的成因。彩色斑叶辣椒叶片超微结构观察发现白斑区、紫斑区细胞中度水肿，胞质内细胞器变化明显，白斑区、紫斑区叶绿体全部或部分缺失、紫斑区大量花色素苷积累，为更好地诠释其内在成因，还需从色素代谢与调控、基因组、转录组水平开展更深入的研究。