参萸养心胶囊抗心肌纤维化作用机制

罗 钢，杨廷富，杨思进，2

1.西南医科大学附属中医医院心血管内科（泸州 646000）；2.西南医科大学附属中医医院国家中医临床研究基地建设单位（泸州 646000）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）现已成为全球导致死亡的首位因素。WHO 数据显示，心血管疾病死亡人数占比高达31%[1]。心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是大多数心血管疾病共同的病理特征，主要表现为心肌成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质过度沉积[2]。现代研究认为过度心肌纤维化会诱发心衰和恶性心律失常等，从而加重患者病情[3-4]。怎样遏制心肌纤维化进展是目前亟需解决的医学难题。然而导致心肌纤维化的原因是多方面的，中医药具有多成分、多靶点、多通路的特点，在治疗心肌纤维化上具有优势[5-6]。

参萸养心胶囊来源于张锡纯《医学衷中参西录》，由山茱萸、丹参、人参组成。人参大补心之阳气，辅以山茱萸益气固脱，丹参清心之淤血，使之补而不滞，利于心脉舒缩启闭之运动而无所妨碍。综全方，益气养阴补心安神，活血通痹，治疗心衰气虚血瘀证。

综上，过度心肌纤维化是心力衰竭发展到失代偿期的最主要病理改变[7]。然而，临床上参萸养心胶囊对心衰病人治疗效果显著，可提高患者生活质量，减少住院次数。因此推测参萸养心胶囊对心肌纤维化可能具有抑制作用。网络药理学具有预测分析中药治疗疾病作用机制的特点，故本研究旨在运用此方法探讨参萸养心胶囊抗心肌纤维化可能的作用机制，为临床应用及后续研究提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 参萸养心胶囊有效成分和靶点的筛选

通过中药计算系统生物实验分析数据库（The tra⁃ditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data⁃Base and Analysis Platform，TCMSP）检索出参萸养心胶囊中人参、丹参、山茱萸的有效成分。设定药物口服利用度≥30%，类药性指数≥0.18为筛选条件，获得相应靶点。再通过Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org）对以上靶点名称标准化。

1.2 疾病靶点的获取

以“myocardial fibrosis”进行检索，通过人类基因数据库Genecards（https://www.genecards.org）获得心肌纤维化相关靶点，筛选相关性得分（Relevance score）≥10的靶点。

1.3 参萸养心胶囊治疗心肌纤维化的网络构建及分析

以1.1 项获得的药物靶点与1.2 项获得的疾病靶点，通过Venny 图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ven⁃ny/）取交集靶点，将交集靶点导入String数据库（https://string-db.org），设置种类为“homo sapiens”，置信度蛋白参数评分（minimum required interaction score）≥0.7，隐藏孤立靶点后，下载TSV 格式蛋白互作关系文件导入Cytoscape3.7.2软件，构建蛋白互作关系网（Protein-Pro⁃tein Interaction Networks，PPI），并进一步筛选核心靶点和关键靶点。再构建“药物-成分-核心靶点-疾病”网络图，从中获得参萸养心胶囊治疗心肌纤维化的重要成分及关键成分。

1.4 核心靶点的基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

通过DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），点击“Functional Annotation”，在Step1 输入核心靶点，Step2 选 择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Step3 选 择“Gene list”，Step3选择“Submit List”，在List菜单中选择“Homo saplens”，则得到GO和KEGG分析结果。

1.5 关键成分及关键靶点的分子对接

从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜查关键成分的结构式，运用ChemBioDraw Ultra 14.0软件制作结构式后复制到ChemBio3D Ultra 14.0软件中，构建三维文件以mol2 格式保存。PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的3D 结构，以PDB格式保存。利用Pymol 软件去水，进行蛋白与配体的拆分，将蛋白由pdb 格式转为pdbqt 格式，AutoDockTools 软件寻找活性口袋，通过Vina软件得出对接分数值来评价其结合活性，再使用Pymol 软件对结果进行可视化。

2 结果

2.1 参萸养心胶囊有效成分和预测靶点

通过TCMSP数据库，筛选得到参萸养心胶囊有效成分共102 个，其中人参22 个，丹参65 个，山茱萸20个，通过Uniprot 数据库将靶点名称标准化后共得到161个靶点，其中人参94个，丹参123个，山茱萸60个。

2.2 心肌纤维化靶点搜集

通过Genecards 数据库获得心肌纤维化相关疾病靶点3 116个，其中相关性评分≥10的靶点406个。

2.3 参萸养心胶囊治疗心肌纤维化的潜在靶点筛选

将上述2.1 项得到的药物靶点和2.2 项相关性评分≥10 的疾病靶点通过Venny 图进行映射得到交集靶点共43个，即为参萸养心胶囊治疗心肌纤维化的潜在作用靶点，见图1。

图1 参萸养心胶囊与心肌纤维化交集靶点韦恩图Figure 1 Wayne diagram of intersection target of Shenyu Yangxin capsule and myocardial fibrosis

2.4 PPI构建和核心成分及靶点筛选

将上述43个潜在作用靶点上传至String数据平台行蛋白互作分析，设置“homo sapiens”“minimum re⁃quired interaction score ≥0.7”，隐藏6个孤立蛋白靶点F7、SCN5A、DPP4、TYR、SLC6A4、NR3C2 后，下载TSV格式蛋白互作关系文件导入Cytoscape3.7.2 软件，构建PPI，见图2。利用该软件CytoHubb 插件进行网络拓扑分析，根据互作网络中节点的节点度（degree），以其43个交集靶点的中位数及以上为核心靶点，共22 个，见表1。设排名前五位为TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3，设它们为重要靶点，再利用Cytoscape 3.7.2软件构建参萸养心胶囊治疗心肌纤维化“药物-成分-核心靶点-疾病”网络图，见图3。通过CytoNCA 插件分析图2，根据Degree排名前10的活性成分，如表2所示，前五位为木犀草素（luteolin，Degree=14.0）、山奈酚（kaempferol，Degree=9.0）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，Degree=7.0）、丹参酮IIA（tanshinone iia，Degree=6.0）、人参皂甙Rh2（ginsenoside rh2，Degree=6.0），设它们为重要成分。

图3 “药物-成分-核心靶点-疾病”图Figure 3 “drug ingredient core target disease”diagram

表1 依据“PPI”中Degree参数排列前22个靶点为核心靶点Table 1 The top 22 targets are the core targets according to the degree parameter in“PPI”

表2 “药物-成分-核心靶点-疾病”网络关系图中中药成分“Degree”前十位Table 2 The top ten of ingredient""degree""in""drug ingredient core target disease""network relationship diagram

图2 交集靶点蛋白互作关系图（PPI）Figure 2 Diagram of intersection target protein interaction（PPI）

2.5 核心靶点富集分析

使用核心靶点导入DAVID 数据库分析，以P <0.05为准，确定GO条目174个，包括239条生物学过程（Biological process，BP），主要涉及RNA 聚合酶II 启动子转录的正调控、基因表达正调控、凋亡过程的负调控等；18条细胞成分（Cell component，CC），主要涉及细胞质、细胞外空间、细胞外区域等；17条分子功能（Molec⁃ular function，MF），主要涉及蛋白质结合、细胞因子活性、相同的蛋白质结合等。均取富集基因数排名前10条作图，见图4。

图4 核心靶点GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of core targets

核心靶点通过DAVID 数据库分析，共得到74 条（P<0.05）KEGG 富集通路，按富集基因数目排序取前20 条信号通路展示，见表3 和图5。分析可知依次是TNF信号通路、结核病、癌症的途径、弓形虫病、乙型肝炎、炎症性肠病、利什曼病、南美锥虫病（美国锥虫病）、甲型流感、癌症中的蛋白聚糖、疟疾、HIF-1信号通路、破骨细胞分化、麻疹、单纯疱疹感染、MAPK信号通路、非洲锥虫病、胰腺癌、百日咳、类风湿关节炎。

图5 点KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis

表3 KEGG通路富集分析前20条参数Table 3 The top 20 parameters of EKGG Pathway enrichment analysis

2.6 关键药物成分-靶点分子对接验证分析

参萸养心胶囊中Degree排名前三为关键成分和靶点，关键成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇与关键靶点TNF、IL6、IL1B 进行分子对接验证。一般认为小于-7.0 kcal/mol-1表示有强烈的结合活性[8]。关键成分的分子结构，见图6。分子对接结果参数见表4。可视化结果展示，见图7。

表4 关键药物成分-关键靶点分子对接参数Table 4 Key drug components-key target molecular docking parameters

图6 关键成分的分子结构Figure 6 molecular structures of key components

图7 关键成分-关键靶点分子对接模式图Figure 7 Diagram of molecular docking mode of key components key targets

3 讨论

本研究筛选出参萸养心胶囊共102 种成分，其中五种重要成分为木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹参酮IIA、人参皂甙Rh2。木犀草素是丹参的主要成分。成纤维化细胞过度增殖分化是心肌纤维化的主要病理表现，WANG T 等[9]在大鼠成纤维细胞实验中证实，木犀草素可以拮抗血管紧张素II刺激成纤维细胞增殖和胶原的合成，山奈酚属于黄酮类化合物，是人参的重要成分。DU Y等[10]实验证实山奈酚可以通过减轻血管紧张素II诱导小鼠心脏的炎症和氧化应激来减少心肌纤维化和心功能障碍。β-谷甾醇是山茱萸和人参的重要成分，WONG HS等[11]发现β-谷甾醇通过线粒体呼吸产生活性氧增强细胞谷胱甘肽氧化还原循环来保护H9c2细胞和大鼠心脏免受氧化应激的损伤，从而保护了心功能。丹参酮IIA是丹参的重要成分，ZHANG Y等[12]在小鼠成纤维细胞实验中证实丹参酮IIA通过抑制β-微管蛋白表达来预防心脏纤维化。人参皂甙Rh2 是人参所含成分，LO SH等[13]在细胞及Ⅰ型糖尿病模型大鼠实验中发现人参皂苷Rh2通过激活PPARδ抑制STAT3信号，最终使心脏纤维化明显改善。由上讨论可见，筛选的参萸养心胶囊重要成分对抗心肌纤维化具有重要作用。

参萸养心胶囊治疗心肌纤维化的交集靶点43个，核心靶点22 个，5 个关键靶点为TNF、IL6、IL1B、VEG⁃FA、STAT3。IL6、TNF 为多效应的细胞因子，与炎症密切相关。FANG L 等[14]研究发现与空白对照组相比，肥厚性心肌病的患者TNF、IL6 水平显着升高，IL-6 与区域纤维化相关。血管紧张素II 是心脏心肌纤维化和心肌肥大重要的致病因素。DUERRSCHMID C等[15]在细胞及小鼠体内实验证实TNF受体1信号传导是血管紧张素II诱导的心脏纤维化的关键因素。IL-1β是心脏病中的关键炎症诱导剂，BRøNNUM H 等[16]细胞实验发现IL-1β的增加抑制了TGF-β1 介导的心肌成纤维细胞分化、增殖，从而减轻了心肌纤维化程度。VEGFA是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，TAO H 等[17]实验证实Mi⁃croRNA-29a 通过靶向VEGFA/MAPK 信号通路抑制心脏成纤维细胞增殖，减轻心肌纤维化。STAT3是信号传导与转录激活因子蛋白家族的一员，可以被不同细胞因子受体激活的蛋白，近年研究表明STAT3 的激活可以通过如协同NF-κB作用[18]，增强Notch-1信号[19]等多种途径对心肌纤维化产生重要影响。由上讨论可见，筛选的参萸养心胶囊重要靶点对抗心肌纤维化具有重要作用。

分子对接结果显示参萸养心胶囊中3个关键成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇与3 个关键靶点TNF、IL6、IL1B 结合能均小于—7.0 kcal·mol-1，表明它们具有强烈的结合活性，从而在理论上验证了参萸养心胶囊可能通过上述成分和靶点抗心肌纤维化。

GO 富集分析显示参萸养心胶囊治疗心肌纤维化主要在RNA 聚合酶II启动子转录的正调控、基因表达正调控、凋亡过程的负调控等方面起作用。根据KEGG富集分析前20 项结果和近年研究报道：TNF 通路涉及炎症及参与导致心肌纤维化的联级反应[20-22]；激活HIF-1α信号通路可增强血管紧张素II诱导心脏纤维化作用[23]；通过增强MAPK 通路致心肌纤维化报道亦甚多[24-26]。表明参萸养心胶囊可能作用于上述多通路途径来抗心肌纤维化。

4 结论

筛选参萸养心胶囊所含的五个重要成分和靶点，且分子对接理论上验证了木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇和TNF、IL6、IL1B相互具有强烈的结合力，故参萸养心胶囊治疗心衰的良好效果，可能源于以木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹参酮IIA、人参皂甙Rh2等为代表的多成分，以TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3等为代表的核心靶点，以TNF、HIF-1α、MAPK 通路等为代表的多通路，多方面起到协同抗心肌纤维化的作用。本研究为后续的临床与实验研究奠定了一定的理论基础，具有重要的指导意义。

（利益冲突：无）