脂肪乳通过LPS/TLR4通路对急性有机磷中毒肺损伤的治疗作用研究*

李 刚,韩楠楠,张 可,李恒杰

(浙江省人民医院/杭州医学院附属人民医院急诊医学科,杭州 310014)

急性有机磷中毒(acute organophosphorus poisoning,AOPP)是我国最常见的急性农药中毒之一,其造成的急性呼吸衰竭是致死的重要因素[1]。AOPP患者临床救治包括使用阿托品、胆碱酯酶复能剂,辅以洗胃、血液灌流等综合治疗[2-3]。然而经上述治疗,患者仍可出现急性肺损伤表现,导致治疗较为棘手。本团队前期的研究及其他研究结果显示,脂肪乳与阿托品、解磷定联合应用,可以减轻AOPP症状,降低病死率,加快胆碱酯酶恢复,减轻AOPP导致的肺损伤[4-6]。但是当时的实验未明确脂肪乳对AOPP肺损伤治疗作用的具体机制。近年来有文献[7]报道,AOPP发生后,脂多糖(LPS)/Toll样受体4(TLR4)表达明显升高,同时NF-κB蛋白在各组织中表达也明显增加,并且LPS/TLR4升高和降低与炎症细胞因子是一致的,并且,给予治疗干预后,LPS/TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、NF-κB均有下降。本研究旨在前期实验结果的基础上,进一步探讨LPS/TLR4通路在脂肪乳对AOPP大鼠肺损伤治疗过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

健康成年封闭Sprague-Dawley大鼠50只,雌雄各半,体重(280±20)g[动物使用许可证号SCXK(沪)2017-0012；合格证号20170012005541],由上海吉辉实验动物有限公司提供。90%敌敌畏(批号：20200813001,荆州安道麦股份有限公司),20%脂肪乳(批号：80PF033,费森尤斯卡比华瑞制药有限公司),阿托品注射液(批号：1811161,天津金耀制药),氯解磷定[批号：19032701,开封制药(集团)有限公司]。LPS/TLR4拮抗剂(批号：66229,美国Med Chem Express有限公司)

1.2 动物饲养条件和饲料

饮用水为灭菌二级超纯水,饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的规定。实验动物房使用许可证号SYXK(浙)2015-0008,饲养环境:温度20～25 ℃,相对湿度40%～70%。在动物房环境中适应2周。维持饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供,执行标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》。

1.3 方法

1.3.1模型制备

将50只大鼠随机(数字随机法)分为A组(盐水对照组)、B组(脂肪乳对照组)、C组(标准治疗组)、D组(脂肪乳治疗组)、E组(LPS/TLR4拮抗剂组)5组,每组10只,5组大鼠均给予90%敌敌畏7 mg/kg腹腔注射染毒(药物剂量是使用该厂家药物预实验确定,确保符合急性重度有机磷中毒且染毒后不会立刻全部死亡)。各组染毒后立即给予不同药物治疗,A组染毒后尾静脉注射生理盐水(5 mL/kg)；B组染毒后尾静脉注射20%脂肪乳(5 mL/kg)；C组染毒后立即予阿托品(10 mg/kg)和氯解磷定(40 mg/kg)肌肉注射；D组在C组的基础上联合应用20%脂肪乳(5 mL/kg)尾静脉注射。E组在D组的基础上应用LPS/TLR4拮抗剂(0.5 mg/kg)尾静脉注射。观察24 h内各组大鼠流涎发生率,统计肌束震颤评分,评分标准：无肌束震颤为0分；口周肌肉出现肌束震颤而其他肌肉偶见肌束震颤为1分；腹肌、后肢肌多处出现肌束震颤为2分；腹肌、后肢肌频繁出现多发性肌束震颤为3分。记录各组大鼠24 h存活率。

1.3.2标本采集、HE染色、荧光定量PCR及流式细胞术检测

染毒后4 h使用毛细导管眶下采血1 mL,用HITACHI7170全自动生化仪测定全血胆碱酯酶活性。染毒24 h后取各组大鼠予腹腔注射5%水合氯醛6 mL/kg麻醉后,立即打开胸腔,无菌条件下分离并取出肺脏,4%甲醛溶液中固定5 d,然后修块、脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色,镜下观察标本的结构。利用荧光定量PCR技术检测肺组织中IL-6、TNF-α、 NF-κB mRNA相对表达量。制备肺细胞悬液,流式细胞术检测肺细胞悬液中LPS/TLR4表达。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠中毒表现和存活情况比较

敌敌畏染毒后,A组和B组中毒症状出现较早,A组大鼠均出现了流涎、肌束震颤、躁动、站立不稳等中毒症状。染毒后24 h内A组只有3只大鼠存活,B组只有4只存活。C组、D组、E组上述症状出现较晚,呼吸困难、肌束震颤、流涎较A组、B组轻。D组与A组、B组、C组3组相比较,存活率明显升高、流涎率明显降低、肌束震颤评分最低、全血胆碱酯酶活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。E组大鼠存活率达90%,而流涎率只有20%,和其余4组比较,存活率、全血胆碱酯酶活性最高,而流涎率、肌束震颤评分最低,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠存活率、流涎率及肌束震颤评分、CHE比较

2.2 各组大鼠肺组织病理学改变

A组肺泡间隔增宽伴水肿及组织间充血,炎症细胞浸润,血管周围疏松水肿、渗出；B组可见肺泡间隔增宽及组织间充血,并见炎症细胞浸润；C组肺泡间隔略增宽,可见少量炎症细胞浸润及红细胞渗出；D组可见少量炎症细胞浸润及红细胞渗出；E组肺泡间隔略增宽,可见少量炎症细胞浸润及红细胞渗出,见图1。

A：A组；B：B组；C：C组；D:D组；E：E组。黑色箭头:炎症细胞浸润;红色箭头:出血。

2.3 各组大鼠肺组织IL-6、TNF-α、NF-κB表达量

B组与A组比较，大鼠肺组织IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；C组与A组比较，大鼠肺组织IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；D组与C组比较，大鼠肺组织IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相对表达量显著降低(P<0.01),见图2。

##:P<0.01,与A组比较；**:P<0.01,与A组比较；△△:P<0.01,与C组比较；□□:P<0.01,与D组比较。

2.4 各组大鼠肺细胞悬液中LPS/TLR4表达

与A组比较,B组肺细胞内LPS/TLR4表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)；D组的LPS/TLR4表达不但较A组、B组明显下降,而且和C组比较,下降也较为明显,差异有统计学意义(P<0.01)；E组和其余4组比较,LPS/TLR4表达均明显降低,差异有统计学意义,见图3。

图3 大鼠肺细胞中LPS/TLR4表达

3 讨 论

肺脏是AOPP较为常见的损伤部位,急性呼吸衰竭是AOPP导致患者死亡较为常见的原因[8]。相关研究[9-10]认为,急性呼吸衰竭的产生主要是由于乙酰胆碱大量积聚引起突触后神经肌肉接头功能障碍,其又分为中毒型肺水肿型、呼吸中枢衰竭型、解毒剂过量型及中间综合征型。临床治疗过程中除使用阿托品、解磷定治疗外,对AOPP所致急性肺损伤无明确有效的治疗药物。本实验结果显示,脂肪乳治疗组与盐水对照组、脂肪乳对照组、标准治疗组比较,大鼠的中毒症状明显减轻、存活率升高、全血胆碱酯酶活性升高、肺组织病理改变明显减轻,和前期研究[4]结果一致。从肺组织HE染色镜下病理结构改变的角度,再一次验证了脂肪乳对AOPP所致肺损伤的治疗作用。

TLR4跨膜蛋白是TOLL受体家族的成员之一[11-12],LPS脂多糖在应激及炎性反应过程中均可升高。LPS/TLR4通路激活会导致细胞内NF-κB信号传递和生成炎症细胞因子,如TNF-α和IL-6,这些因子在对外界刺激反应的识别和组织损伤过程中起到重要的作用[13]。LPS发生改变后组织中的TLR4、NF-κB及血液和组织中的TNF-α、IL-6的表达均会改变[14]。本实验结果显示,各组大鼠给予敌敌畏染毒后,肺组织LPS/TLR4明显升高,同时NF-κB蛋白表达也明显增加,并且LPS/TLR4的升降与炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平是一致的；给予阿托品、解磷定标准治疗干预后,LPS/TLR4、TNF-α、IL-6、NF-κB均有下降,并且下降程度和盐水对照组比较差异有统计学意义,同样与中毒症状及肺组织损伤程度呈相关。说明AOPP在发病和治疗过程中LPS/TLR4通路起到了重要作用,该实验结果与文献[4]报道一致。

本实验发现,无论是脂肪乳对照组和盐水对照组比较,还是脂肪乳治疗组和标准治疗组比较,只要加入脂肪乳治疗,该组实验大鼠肺组织IL-6、TNF-α、NF-κB表达量均明显下降,同时,肺细胞悬液中LPS/TLR4表达同步下降。众所周知,脂肪乳具有结合LPS的特性,进而可抑制巨噬细胞的激活。脂肪乳中的磷脂和高密度脂蛋白,在体内和体外结合LPS并可起到中和作用,LPS诱导的细胞因子反应会减弱。研究[12]表明,脂肪乳与LPS作用后,LPS即失去了结合能力,从而抑制TNF-α、IL-6的释放。脂肪乳可以抑制LPS/TLR4,从而使TNF-α、IL-6释放减少,TLR4与LPS拮抗剂结合,几乎完全可以抑制TNF-α、IL-6释放。本实验结果显示,LPS/TLR4阻断组肺细胞悬液中LPS/TLR4表达、IL-6、TNF-α、NF-κB中mRNA相对表达量与其他4组相比是最低的。同时在实验中还可以发现,LPS/TLR4阻断组AOPP症状最轻、存活率最高、胆碱酯酶活性最高、肺组织病理改变最接近于正常大鼠肺组织。

本实验证明,脂肪乳可以减轻AOPP所致肺损伤；LPS/TLR4通路在治疗AOPP所致肺损伤的过程中发挥了重要作用。