HPLC法测定葛根养生酒中葛根素含量的分析研究

王 丹，吴小娟，刘小刚，兰 余，吉 喆，吴卫宇，马 康，周成坪，袁 强，罗 爽，邓有辉

（1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；2.四川国检检测有限责任公司，四川泸州 646000；3.泸州老窖养生酒业有限责任公司，四川泸州 646000）

葛根素是从豆科植物葛根中提取的一种异黄酮类化合物，具有抗心律失常、抗心肌缺血、扩张血管、改善微循环、降血脂、降血糖、增加脑血流量、保护脑神经细胞、抗氧化、防醉酒、治醉酒和对抗酒精性肝损伤等作用。随着人们健康意识的不断提升，葛根被应用到食品、药品等多个领域。葛根酒是一类健康养生酒，以传统白酒为酒基，葛根为主要原料，辅以其他食药原材，经现代萃取技术将食药材中的风味、活性等成分融入到酒体中，形成在风味、口感上区别于传统白酒的养生酒。近年来，葛根酒市场发展比较快，受到消费者喜爱。

目前，对于原料中葛根素的检测已有相关研究，如高效液相色谱法、分光光度法、薄层扫描法、毛细管电泳法、近红外光谱法、酶联免疫吸附测定法等分析方法，其中高效液相色谱法检测效果较好。然而，对于酒类中的葛根素检测却鲜有报道。在酒体中乙醇及其他原辅料成分可能会对葛根素的检测造成干扰，影响稳定性及准确度。本试验主要探讨葛根养生酒中葛根素含量的高效液相色谱（HPLC）检测法，优化相关检测参数，以期为养生酒葛根素含量检测提供快速可靠的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

葛根养生酒样品：泸州老窖养生酒业有限责任公司提供。

试剂及耗材：甲醇、冰乙酸均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；葛根素标准品（纯度≥95%），上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水符合GB/T 6682中一级水的规定。

仪器设备：LC 1260 II 高效液相色谱仪，美国Agilent公司；超纯水制备仪，美国Millipore公司；电子天平，赛多利斯科学仪器；恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱检测条件

色谱柱：JADE-PAK ODS-AQ C水相柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：250 nm，进样量：10 µL；流动相：甲醇（A）-0.1 %乙酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 葛根素标准溶液的制备

葛根素标准储备液配制：精密称取10.0 mg 葛根素标准品用甲醇溶解并定容至10 mL，混匀，得浓度为1.00 mg/mL 的标准品储备液，于4 ℃下保存备用。

葛根素标准系列工作液：用水将葛根素标准储备液稀释成浓度为1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L的标准工作溶液。

1.2.3 样液制备方法

葛根素含量＞100 mg/kg 的养生酒：根据其含量，称取混匀试样2～5 g（精确至0.0001 g），用水稀释成适当浓度，经0.45µm微孔滤膜过滤后，待液相色谱分析。

葛根素含量≤100 mg/kg 的养生酒：称取混匀试样10 g（精确至0.0001 g），水浴加热去除乙醇，加水溶解转移至10 mL 容量瓶，定容后摇匀，经0.45µm微孔滤膜过滤后，待液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 流动相配比与洗脱方式选择

选择不同流动相进行系统适用性比较，分别试验比较了甲醇-水（30∶70）、甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）下的出峰情况，发现采用甲醇-水（30∶70）时，上机采集20 min 内目标峰不出；采用甲醇-0.1%乙酸水（30∶70）等度洗脱时，13 min 左右出现目标峰且峰形较好，综合考虑时间成本，选择甲醇-0.1 %乙酸水作为流动相。

分别考察了甲醇-0.1 %乙酸水等度洗脱和梯度洗脱效果，采用甲醇-0.1 %乙酸水（30∶70）等度洗脱时，杂峰在目标峰出现后近20 min内仍不能完全流出，会严重干扰下一针采集，故采用甲醇-0.1%乙酸水梯度洗脱的方式，洗脱程序见表1，结果表明，梯度洗脱效果较好，该条件下葛根素标准品的色谱图见图1。

图1 葛根素标准溶液及不同方法制备的酒样供试液色谱图

2.2 样品前处理方法的选择

考虑到以葛根为主要原料的养生酒样若直接过滤进样检测，乙醇可能对峰型和葛根素含量有影响，对高葛根素含量（＞100 mg/kg）养生酒采用经水稀释后过微孔滤膜再检测。对葛根素含量（≤100 mg/kg）相对较低的养生酒，为避免过度稀释对检测结果准确性的影响，同时提高检测响应值，考察了水浴除去乙醇后加水定容样和不除去乙醇样对检测时出峰峰型和葛根素含量的影响。

结果（见图1）表明，是否水浴加热除去乙醇对葛根素含量无较大影响，但不除去乙醇会造成葛根素色谱峰前拖尾，色谱峰较宽，在6.3 min 附近多1个杂峰。同时采用加标回收试验进一步考察水浴加热除乙醇下葛根素的热稳定性，酒样在20 mg/kg加标水平下的检测结果表明，葛根素的平均加标回收率为99.8 %，说明葛根素回收率高，热稳定性良好。综合考虑到当色谱柱柱效下降后，不除去乙醇样品色谱峰峰型可能会变差，故选择采用水浴加热法处理葛根素含量（≤100 mg/kg）相对较低的养生酒样。

2.3 检出限、定量限和线性关系

当葛根素标液稀释至浓度为0.10 mg/L 进行上机检测时，信噪比为5.8，更低稀释浓度时，信噪比小于3，因此，将0.10 mg/L 确定为仪器最低检测浓度。取6 份阴性空白酒样10 g，以0.10 mg/kg 水平加入葛根素标液，水浴挥发乙醇后，加水转移定容至10 mL 容量瓶，上机测定，发现6 次加标测定信噪比均大于3，结合直接稀释葛根素标液浓度为0.10 mg/L 时信噪比，按照信噪比S/N≥3 和S/N≥10 确定方法检出限为0.10 mg/kg，定量限为0.40 mg/kg。

取浓度为1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L 的葛根素标准溶液，在优化后的色谱条件上机检测。以葛根素质量浓度（mg/L）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得出葛根素浓度在1.0～120 mg/L 范围内时，峰面积y与质量浓度x 呈良好线性关系（y=45.849x-6.1179，R=0.9999）。

2.4 精密度试验

精密吸取同一酒样，按优化后的方法制备供试样液，重复进样测定6 次，计算出峰时间和峰面积（n=6）的RSD，结果见表2。

由表2 可知6 次测定的保留时间和峰面积相对标准偏差均较小，表明仪器精密度良好。

表2 6次平行测定的保留时间和峰面积

2.5 重复性试验

取两个葛根素浓度水平的养生酒即样品A 和样品B 各1 批次，每批次样分别平行称定6 份，按照优化后的方法制备供试液各6 份进样测定，测得结果见表3。由表3 可知，测定结果相对标准偏差分别为0.7%、1.9%，方法重复性良好。

表3 重复性试验结果(n=6)

2.6 加标回收率试验

精密称取约10 g 养生酒阴性空白样品，按照0.40 mg/kg、4.0 mg/kg、40.0 mg/kg 3 个浓度水平添加葛根素标准溶液，按1.2 项下优化后的供试样制备方法和色谱条件进行检测，加标回收试验结果见表4。

表4 样品在不同加标浓度下的回收率(n=6)

由表4 可以看出，该养生酒中葛根素含量的检测方法回收率良好且比较稳定，符合GB/T 27404—2008附录F中对回收率的要求。

2.7 稳定性试验

取同一个养生酒供试样溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h 上机测定，测得其响应峰面积见表5。由表5 可知，在48 h 内测得的响应面积相对标准偏差小于10 %，表明样品试样溶液放置于室温下48 h内测定仍能满足检测精密度要求。

表5 稳定性试验结果(n=6)

3 结论

本研究优化了高效液相色谱条件，筛选了适用于不同葛根素浓度水平的养生酒样品前处理方法，建立了高效、适用的HPLC 方法测定养生酒中葛根素的含量。该方法在1.0～120 mg/L 范围内线性关系良好，相关系数R为0.9999，线性方程y=45.849x-6.1179，方法检出限、定量限分别为0.10 mg/kg、0.40 mg/kg；仪器精密度较好，响应峰面积的相对标准偏差为0.22 %；方法重复性较好，两个不同葛根素浓度的养生酒样品6 次平行试验测定结果分别为2765.1 mg/kg、11.5 mg/kg，相对标准偏差分别为0.7%、1.9%；养生酒样品在加标浓度为0.4 mg/kg、4.0 mg/kg 和40 mg/kg 3 个水平下，回收率范围为90.52 %～93.98 %（n=6），相 对 标 准 偏 差 为0.57%～2.37%，满足相关标准要求。该方法操作简单，具有检测灵敏度高、分析时间短、稳定性好、准确可靠的特点，是检测养生酒中葛根素含量的有效方法。